第四章 抗体制药

1、 抗体抗体是指能与相应抗原特异性是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白。结合具有免疫功能的球蛋白。 抗体的产生抗体的产生：机体免疫系统受：机体免疫系统受抗原刺激后，抗原刺激后，B B淋巴细胞被活化增淋巴细胞被活化增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。和分泌的球蛋白。 免疫球蛋白是化学结构上的概念，抗体是生物学功能上免疫球蛋白是化学结构上的概念，抗体是生物学功能上的概念，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白的概念，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有免疫球蛋白都具有抗体活性都具有抗体活性抗体产生的机制：抗体产生的机制： 抗原物质抗原物质 机体

2、免疫系统机体免疫系统 B B淋巴细胞淋巴细胞 浆细胞浆细胞 球蛋白球蛋白刺激刺激激活激活分化、增殖分化、增殖分泌分泌 20 20世纪世纪6060年代发现多发性骨髓年代发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病。病人血清中出现同抗体结构疾病。病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白，类似的球蛋白， 统称为统称为免疫球蛋免疫球蛋白白（immunoglobulinimmunoglobulin，IgIg）。所以）。所以IgIg是化学结构的概念，而是化学结构的概念，而抗体抗体是生是生物学功能的概念。物学功能的概念。 多克隆抗体多克隆抗体：病原微生物含：病原微生物含有多种抗

3、原决定簇的抗原物质，有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称多克隆抗体。的混合物，故称多克隆抗体。 单克隆抗体作为抗体制剂，在临单克隆抗体作为抗体制剂，在临床上主要用与疾病的诊断和治疗。床上主要用与疾病的诊断和治疗。 单克隆抗体检测与某些疾病有关单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原，辅助临床诊断。用放射性的抗原，辅助临床诊断。用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，做免疫定位诊断。做免疫定位诊断。单克隆抗体用于临床治疗，单克隆抗体用于临床治疗，CD3CD3单克隆单克隆抗体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抗

4、体作为免疫抑制剂对器官移植免疫排斥有抑制作用。抑制作用。 以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进以单克隆抗体作为载体的药物对肿瘤进行定向治疗。行定向治疗。McAbMcAb的改造的改造1.1.改造的必要性改造的必要性 单克隆抗体均是鼠源性抗体，直接应用于人单克隆抗体均是鼠源性抗体，直接应用于人体易产生人抗鼠免疫反应体易产生人抗鼠免疫反应 完整抗体分子的相对分子量过大，难以穿透完整抗体分子的相对分子量过大，难以穿透肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度 2.2.改造方向改造方向 降低单克隆抗体的免疫原性降低单克隆抗体的免疫原性 降低单克隆抗体的相对分子量降低单克隆抗体的相对分子量

5、 免疫的方法免疫的方法采用体内免疫法和体采用体内免疫法和体外免疫法：外免疫法： 体内免疫法体内免疫法适用于免疫原性强、适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用抗原量较多时应用，一般用8 81212周周龄雌性鼠。龄雌性鼠。 颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）颗粒性抗原（如细菌细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔入腹腔1010个细胞进行初次免疫，间隔个细胞进行初次免疫，间隔1 13 3周，再追加免疫周，再追加免疫1 12 2次。次。7体外免疫法体外免疫法 二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养细胞融合的方法：细胞融合的方法：

6、 脾细胞（脾细胞（1108） 骨髓瘤细胞（骨髓瘤细胞（2107）混合）混合 聚乙二醇诱导下融合，聚乙二醇诱导下融合，2分钟，然后用培养分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。液将融合液缓慢稀释。 用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具有融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强，长期稳定。分泌抗体能力强，长期稳定。 PEG相对分子量相对分子量4000，浓度为，浓度为50% 二甲基亚砜增加融合率。二甲基亚砜增加融合率。 细胞融合后可产生多种融合。细胞融合后可产生多种融合。脾脾脾、脾脾、脾瘤、瘤瘤、瘤瘤融合细胞。瘤融合细胞

7、。选择性培养选择性培养: 培养基培养基 为为HAT培养液。培养液。 次黄嘌呤次黄嘌呤(H)氨甲喋氨甲喋呤呤(A)胸腺嘧啶胸腺嘧啶(T)配制。配制。 A阻断阻断DNA合成。合成。三、筛选阳性克隆与克隆化三、筛选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆常用检测方法：筛选阳性克隆常用检测方法： 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。集团的整个培养过程。四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。它是鉴定的客观杂交瘤细胞鉴

8、定：染色体分析。它是鉴定的客观指标，了解分泌抗体的能力。指标，了解分泌抗体的能力。 单抗进行单抗进行Ig类和亚类鉴定：类和亚类鉴定： 用羊或兔抗用羊或兔抗Ig不同类或亚类抗体，进行免疫扩散不同类或亚类抗体，进行免疫扩散或或ELISA鉴定。鉴定。 亲和力、特异性、纯度、分子量测定亲和力、特异性、纯度、分子量测定五、五、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备六、六、单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化第三节第三节 基因工程抗体及其制备基因工程抗体及其制备杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改及毒副作用。对鼠源性的

9、单抗进行基因加工和改造。造。 目的：降低免疫源性；降低相对分子量。目的：降低免疫源性；降低相对分子量。 人人-鼠嵌合抗体、改形抗体鼠嵌合抗体、改形抗体 、小分子抗体。、小分子抗体。二、抗体的结构及基因组成二、抗体的结构及基因组成（一）抗体的结构（图（一）抗体的结构（图4-44-4）抗体分子的结构是由二硫键连接起来的约抗体分子的结构是由二硫键连接起来的约4 4条多肽链条多肽链 N-N-端端 区段区段 2 2条条H H链链：约：约450450570570个个aaaa组成组成 C- C-端端 区段区段 N-端端 区段区段 2 2条条L L链链：约：约214214个个aaaa组成组成 C-端端 区段区

10、段 41432121IgIg分子分子aaaa组成和排列顺序多组成和排列顺序多变，称为变，称为可变区（可变区（V V区）区）aa组成和排列比较恒组成和排列比较恒定，称为定，称为恒定区（恒定区（C区）区） 1.1.在在V V区，某些特定位置的区，某些特定位置的aaaa残基显示更大的变异残基显示更大的变异性，构建了抗体分子和抗原分子发生特异性结合的性，构建了抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，称为关键部位，称为互补决定区（互补决定区（CDRCDR），抗体能与特定抗体能与特定抗原特异性结合与抗原特异性结合与CDRCDR密切相关）密切相关） 2.2.C C区决定抗体分子的异种抗原性区决定抗体分子

11、的异种抗原性（二）抗体结构与性质的关系（二）抗体结构与性质的关系 抗原抗体结合功能抗原抗体结合功能抗体可变区（抗体可变区（V） 同种性免疫源性同种性免疫源性抗体稳定区（抗体稳定区（C） 在基因水平上将鼠源单抗的在基因水平上将鼠源单抗的H 和和L链可变区基链可变区基因分离出来，分别与人因分离出来，分别与人Ig的的H 和和L链的稳定区（链的稳定区（C）基因连接成人基因连接成人-鼠嵌合抗体的鼠嵌合抗体的H 和和L链基因，再共链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人转染骨髓瘤细胞，就能表达完整人-鼠嵌合抗体。鼠嵌合抗体。二、改形抗体（二、改形抗体（CDR移植抗体）移植抗体）Ig Ig 分子中参与构成

12、抗原结合部位的区域是分子中参与构成抗原结合部位的区域是H H和和L L链链V V区中的互补决定区（区中的互补决定区（CDRCDR区），而不是整区），而不是整个可变区。个可变区。 H H和和L L链各有三个链各有三个CDRCDR，其它部分称，其它部分称框架区。框架区。 用用鼠源单抗的鼠源单抗的CDRCDR序列替换人序列替换人Ig Ig 分子中分子中CDRCDR序序列，则可使人的列，则可使人的Ig Ig 分子具有分子具有鼠源单抗的抗原结鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。合特异性。可消除免疫源性。三、小分子抗体三、小分子抗体 1.1.结构特征：结构特征：基因工程的小分子抗体仅表达鼠源性单克隆

13、抗体的基因工程的小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V V区片段，其相对分子量仅为原抗体的区片段，其相对分子量仅为原抗体的 到到2.2.类型：类型：FabFab片段抗体：由完整的轻链和重链的可变区加部分恒片段抗体：由完整的轻链和重链的可变区加部分恒定区定区 FVFV抗体：由重链和轻链的可变区组成抗体：由重链和轻链的可变区组成 单链抗体单链抗体：由：由V VH H链和链和V VL L链的链的CDRCDR通过一段连接肽连接而通过一段连接肽连接而成的重组蛋白成的重组蛋白 单域抗体：由单域抗体：由H H链或链或L L链的单个链的单个CDRCDR区组成；分子量只有区组成；分子量只有原抗体，表面疏水性强，与

14、抗原的非特异性结合能力较强原抗体，表面疏水性强，与抗原的非特异性结合能力较强 最小识别单位（最小识别单位（MRUMRU）：由互补决定区构成；也具有与）：由互补决定区构成；也具有与抗原结合的能力，但亲和力极低抗原结合的能力，但亲和力极低12180131 1.1.单链抗体的优点单链抗体的优点可以去除许多造成非特异反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显像的背景更清晰可以去除许多造成非特异反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显像的背景更清晰更容易渗透到肿瘤组织中去，增加有效药物浓度更容易渗透到肿瘤组织中去，增加有效药物浓度相对分子量小，所以鼠源性抗体的免疫原性小，能消除人抗鼠的排斥反应，相对分子量小，所以鼠源性抗体的免疫

15、原性小，能消除人抗鼠的排斥反应， 延长其在人体内的半衰期延长其在人体内的半衰期2.2.单链抗体在大肠杆菌中表达单链抗体在大肠杆菌中表达非融合表达：以游离的形式直接在细胞质中表达非融合表达：以游离的形式直接在细胞质中表达融合表达：与菌体蛋白融合表达（融合表达：与菌体蛋白融合表达（N-N-端为端为E.ColiE.Coli菌体蛋白，菌体蛋白，C-C-端为抗体蛋白）端为抗体蛋白）分泌表达分泌表达：与信号肽基因相连接，产物分泌到胞外；具有功能的单链抗体：与信号肽基因相连接，产物分泌到胞外；具有功能的单链抗体 u 单链抗体的优点与表达形式单链抗体的优点与表达形式第四节第四节 多功能抗体及其制备多功能抗体及

16、其制备双功能抗体双功能抗体 （研制阶段）（研制阶段）双功能抗体双功能抗体 （研制阶段）（研制阶段）1.1.概念：概念：又称为双特异性抗体（又称为双特异性抗体（BsAbBsAb），是由人工构），是由人工构建的，具有同时与两种抗原特异结合的双臂抗体建的，具有同时与两种抗原特异结合的双臂抗体2.2.双功能抗体的优点：双功能抗体的优点：一个臂识别肿瘤细胞表面抗原，一个臂识别肿瘤细胞表面抗原，包括肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的白细胞分化包括肿瘤相关抗原、癌基因产物、特殊的白细胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特异性受体等，并有效结合；抗原、病毒蛋白抗原、特异性受体等，并有效结合；另一个臂可识别免疫效应细胞及分

17、子，如另一个臂可识别免疫效应细胞及分子，如CD3CD3、毒素、毒素、药物等，介导药物等，介导T T淋巴细胞、淋巴细胞、LAKLAK细胞或毒素与药物发挥细胞或毒素与药物发挥细胞毒作用。细胞毒作用。 即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞的效应细胞, ,将效应细胞富集在肿瘤周围将效应细胞富集在肿瘤周围, ,而且而且可以模拟天然配体的作用可以模拟天然配体的作用, ,与细胞表面引发分子与细胞表面引发分子结合结合, ,激活效应细胞激活效应细胞, ,实现对肿瘤细胞的杀伤和实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。裂解。 双功能抗体在治疗肿瘤、自身免疫疾病、双功能抗体在治疗肿瘤

18、、自身免疫疾病、病毒性疾病中将会产生巨大的应用价值。病毒性疾病中将会产生巨大的应用价值。 （1 1）化学交联法：）化学交联法：将两个抗体交联在一起，此法快速、将两个抗体交联在一起，此法快速、简便、高效，纯化简便、高效，纯化 简单；但此法构建的双功能抗体，简单；但此法构建的双功能抗体，可能由于化学交联过程会影响抗体的功能，不太容易可能由于化学交联过程会影响抗体的功能，不太容易达到靶部位，体内稳定性较差，且无连续性等达到靶部位，体内稳定性较差，且无连续性等3.3.构建方法构建方法（2 2）生物学方法（杂种）生物学方法（杂种- -杂交瘤法）：杂交瘤法）：将普通抗将普通抗体产生细胞（脾细胞）与产生体产

19、生细胞（脾细胞）与产生McAbMcAb的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞融合而成；此法连续性好，但构建过程复杂、周融合而成；此法连续性好，但构建过程复杂、周期长、纯化技术复杂，基因组过大且不稳定，又期长、纯化技术复杂，基因组过大且不稳定，又不能对双功能抗体进行改造。故不常用不能对双功能抗体进行改造。故不常用（3 3）基因工程法：）基因工程法：19931993年由年由HolligenHolligen等人首次等人首次构建而成，即用人工接头连接不同抗体的构建而成，即用人工接头连接不同抗体的V VH H和和V VL L，以融合蛋白的形式表达以融合蛋白的形式表达 非共价键二聚体非共价键二聚体VHA-VHA-肽肽-

20、VLB -VLB VLA-VLA-肽肽-VHB-VHB 共价连接双特异性单链抗体共价连接双特异性单链抗体VHA-VHA-肽肽-VLA-VLA-连接肽连接肽- VLB- VLB-肽肽-VHB-VHB 应用亮氨酸拉链、螺旋应用亮氨酸拉链、螺旋- -转角转角- -螺旋等蛋白质结构螺旋等蛋白质结构域将两单链抗体连接起来。域将两单链抗体连接起来。VHA-VHA-肽肽-VLA-Leu-VLA-Leu拉链（铰链区）拉链（铰链区）- VLB- VLB-肽肽-VHB-VHB4. 制备制备BisFvs的方法的方法 核心是将两条核心是将两条SCFV以一定方式连接起来，并使以一定方式连接起来，并使其各自保留与特异性抗

21、原结合的能力。其各自保留与特异性抗原结合的能力。 亮氨酸拉链实质上是一段长约亮氨酸拉链实质上是一段长约35个氨基酸的寡肽，个氨基酸的寡肽，其中每其中每7个氨基酸出现一个亮氨酸残基，共有个氨基酸出现一个亮氨酸残基，共有5个亮个亮氨酸残基。利用亮氨酸拉链介导氨酸残基。利用亮氨酸拉链介导SCFV或或Fab片段在片段在细胞内二聚化连接细胞内二聚化连接2种分子可以制备基因工程同质种分子可以制备基因工程同质双价或异质双特异性双价或异质双特异性Bs(sFv)2和和(Fab)2小抗体。亮小抗体。亮氨酸拉链作为一种具有特殊作用的短肽，是双特异氨酸拉链作为一种具有特殊作用的短肽，是双特异性抗体制备最简单的模型系统

22、性抗体制备最简单的模型系统 将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。将双链抗体的一条臂针对抗肿瘤细胞的作用。将双链抗体的一条臂针对抗原，另一臂针对免疫球蛋白，这种双链抗体可原，另一臂针对免疫球蛋白，这种双链抗体可与免疫球蛋白结合，恢复抗体的全部功能，包与免疫球蛋白结合，恢复抗体的全部功能，包括结合补体、诱导单核细胞内的呼吸爆发和吞括结合补体、诱导单核细胞内的呼吸爆发和吞噬功能、增强噬功

23、能、增强T细胞杀伤细胞的协同作用等。细胞杀伤细胞的协同作用等。 5. 在治疗中的应用在治疗中的应用 利用其能与利用其能与2 2个抗原结合的能力，设计出更高效个抗原结合的能力，设计出更高效的免疫阻断抗体、免疫组化抗体等。的免疫阻断抗体、免疫组化抗体等。 Kontermannn Kontermannn等设计的双特异抗体，一条臂可与等设计的双特异抗体，一条臂可与抗原蛋清溶菌酶抗原蛋清溶菌酶(HEL)(HEL)、癌胚抗原、癌胚抗原(CEA)(CEA)、HIVHIV一一1GP1201GP120结合，另一条臂为抗大肠杆菌半乳糖苷酶。以结合，另一条臂为抗大肠杆菌半乳糖苷酶。以该双链抗体作为酶结合物，用该双链

24、抗体作为酶结合物，用ELISAELISA法检测法检测HELHEL，免疫，免疫组化法检测组化法检测CEACEA，免疫印迹法检测，免疫印迹法检测GP120GP120，加人特异抗，加人特异抗体后，再加人体后，再加人B B半乳糖苷酶，洗涤后加人底物显色，半乳糖苷酶，洗涤后加人底物显色，结果表明，这些方法可检出相应的抗原，证明双特异结果表明，这些方法可检出相应的抗原，证明双特异抗体可用于酶免疫分析。抗体可用于酶免疫分析。6. 6. 在免疫诊断中的应用在免疫诊断中的应用 Atwell等制备的双特异抗体，一条臂抗红细胞表等制备的双特异抗体，一条臂抗红细胞表面血型糖蛋白的，另一条臂抗神经氨酸酶，中间用面血型糖

25、蛋白的，另一条臂抗神经氨酸酶，中间用一段一段5个氨基酸个氨基酸(Gly4Set)的接头连接。这段接头的的接头连接。这段接头的作用是阻止作用是阻止VH、VL结合于一个分子，并稳定二聚体结合于一个分子，并稳定二聚体的形态。该抗体可与上述抗原结合，以此建立快速的形态。该抗体可与上述抗原结合，以此建立快速的全血凝集试验。的全血凝集试验。 多功能抗体多功能抗体-单链抗体多聚体（单链抗体多聚体（SCFV多聚体）多聚体） 在在SCFV的基础上发展了结合性能良好的的基础上发展了结合性能良好的SCFV多聚体，包括二聚体、三聚体和四聚体等，这些多聚体，包括二聚体、三聚体和四聚体等，这些多价、多效能、高亲和力的新型

26、小分子抗体较单多价、多效能、高亲和力的新型小分子抗体较单链抗体具有诸多优势。链抗体具有诸多优势。 其显著优点是它的高亲和力性能，由于具有多其显著优点是它的高亲和力性能，由于具有多个结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个个结合价，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个靶抗原结合，与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有靶抗原结合，与肿瘤细胞表面抗原的多价结合有利于肿瘤的影象分析及治疗。利于肿瘤的影象分析及治疗。 有应用价值的有应用价值的SCFV多聚体应具有以下特征：多聚体应具有以下特征：1）能高选择、高亲和性地同靶抗原或肿瘤相关抗原）能高选择、高亲和性地同靶抗原或肿瘤相关抗原结合结合2）在血液循环中，与效应细

27、胞或细胞毒触发分子有）在血液循环中，与效应细胞或细胞毒触发分子有较低亲和力较低亲和力3）应为人源化抗体，最大限度地减少人抗鼠蛋白的）应为人源化抗体，最大限度地减少人抗鼠蛋白的排斥反应，使重复给药不受限制排斥反应，使重复给药不受限制4）分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又）分子应大小适中，既能渗透到肿瘤组织内部，又能保持适当的滞留时间能保持适当的滞留时间 抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性的融合蛋白具有新的特性, ,称之为抗体融合蛋白。称之为抗体融合蛋白。 抗体融合蛋白抗体融合蛋白 配基配基 - - 配基型融合蛋白配基型融合蛋白

28、配基配基 - Ig- Ig型嵌合蛋白型嵌合蛋白1.1.常见类型常见类型 配基配基 - FV- FV嵌合蛋白嵌合蛋白 受体受体FVFV型融合蛋白型融合蛋白 酶酶 - - 抗体型融合蛋白（抗体酶）抗体型融合蛋白（抗体酶）2.2.构建抗体融合蛋白的原则构建抗体融合蛋白的原则 将前一个蛋白的终止密码子删除，再接上带将前一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因的共表达。基因的共表达。在抗体的在抗体的N端和端和C端融合其它蛋白端融合其它蛋白都可以获得成功。关键是两个蛋白间的接头序列都可以获得成功。关键是两个蛋白间的接头序列l

29、inker，一般说来，一般说来35个氨基酸就可满足大部分融个氨基酸就可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。如加入一段有疏水性合蛋白的正确折叠的要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性的长链，可缓解两种蛋白的相互干和一定伸展性的长链，可缓解两种蛋白的相互干扰。扰。 基因工程抗体与基因工程抗体与IL-2的融合蛋白在肿瘤治疗中可特的融合蛋白在肿瘤治疗中可特异性将异性将IL-2的作用集中在肿瘤局部，以减少对周身的作用集中在肿瘤局部，以减少对周身的副作用。的副作用。 抗体融合蛋白能特异定位于肿瘤局部，输送高浓度抗体融合蛋白能特异定位于肿瘤局部，输送高浓度的的IL-2，从而充分发挥细胞因子激活的效应细胞杀，从

30、而充分发挥细胞因子激活的效应细胞杀伤肿瘤细胞的作用。伤肿瘤细胞的作用。 酶酶- -抗体型融合蛋白抗体型融合蛋白- -抗体酶或催化性抗体抗体酶或催化性抗体（Abzyme or Catalytic antibodyAbzyme or Catalytic antibody） 抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法1 1）使用与过度态结构相似的半抗原通过杂交瘤方法生）使用与过度态结构相似的半抗原通过杂交瘤方法生产；产；2 2）对抗体分子进行化学修饰，使抗体分子与催化基因）对抗体分子进行化学修饰，使抗体分子与催化基因相连；相连；3 3）通过过度态类似分子对抗体库进行筛选获得符合要）通过过度态类似分子对抗体库进

31、行筛选获得符合要求的抗体酶。求的抗体酶。 抗体酶在药学方面的应用主要表现在抗体酶在药学方面的应用主要表现在：1 1）抗体酶前体药物疗法，即利用抗体酶将靶部位的）抗体酶前体药物疗法，即利用抗体酶将靶部位的前体转化成有效的药物，这样可以提高该处的药物前体转化成有效的药物，这样可以提高该处的药物浓度，避免药物对正常组织的伤害；浓度，避免药物对正常组织的伤害；2 2）在药物合成中实现普通有机化学反应以及催化反）在药物合成中实现普通有机化学反应以及催化反应难以实现的药物合成反应，尤其在抗生素和天然应难以实现的药物合成反应，尤其在抗生素和天然药物的合成方面应用较多；药物的合成方面应用较多；3 3）抗体酶还

32、可以用于选择性地水解病毒蛋白的肽键，）抗体酶还可以用于选择性地水解病毒蛋白的肽键，从而阻止病毒与靶细胞结合，或是选择性地水解癌从而阻止病毒与靶细胞结合，或是选择性地水解癌细胞膜上的蛋白质，从而有效地破坏癌细胞膜，达细胞膜上的蛋白质，从而有效地破坏癌细胞膜，达到治疗癌症的目的。到治疗癌症的目的。（1 1）其中较为成熟的是配基）其中较为成熟的是配基-Ig-Ig型嵌合蛋白，而酶型嵌合蛋白，而酶- -抗抗体型融合蛋白（即抗体酶，体型融合蛋白（即抗体酶，abeneymeabeneyme）在药物治疗中）在药物治疗中应用前景广阔，它可在靶向位置上将前体药物转化成应用前景广阔，它可在靶向位置上将前体药物转化成

33、有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶介导的酶前体药物前体药物治疗（治疗（ADEPTADEPT）。）。（2 2）抗体酶在药物治疗中的应用前景被医学界普遍看）抗体酶在药物治疗中的应用前景被医学界普遍看好，好，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶前体前体药物药物治疗。治疗。3.3.抗体融合蛋白的应用抗体融合蛋白的应用 前体药物：该药物需在体内经特定酶催化后前体药物：该药物需在体内经特定酶催化后才显示活性

34、的药物。才显示活性的药物。 当抗体和酶的融合蛋白定位在肿瘤部位后再当抗体和酶的融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前体药物，其优点是提高肿瘤区域的药物浓给予前体药物，其优点是提高肿瘤区域的药物浓度，降低对正常细胞的毒性。该方法可使药物浓度，降低对正常细胞的毒性。该方法可使药物浓度在肿瘤部位提高度在肿瘤部位提高1010倍，而在正常组织中降低倍，而在正常组织中降低223 3倍。倍。 免疫融合蛋白基因表达可用真核细胞，也可用免疫融合蛋白基因表达可用真核细胞，也可用原核细胞表达（分泌原核细胞表达（分泌/包含体表达）。包含体表达）。 基因工程抗体与基因工程抗体与IL-2的融合蛋白能特异定位于肿的融合蛋白能特异

35、定位于肿瘤局部，减少对周身的不良反应。瘤局部，减少对周身的不良反应。 CTLA4-Ig的应用：的应用： T细胞活化需要两个信号，只接受第一个信号时，细胞活化需要两个信号，只接受第一个信号时，并不产生活化，而是进入无反应状态，甚至导并不产生活化，而是进入无反应状态，甚至导致程序性死亡，许多分子参与第二信号的传递，致程序性死亡，许多分子参与第二信号的传递，其中其中B7和和CD28/CTLA4被认为是最重要的共刺被认为是最重要的共刺激分子。激分子。 CTLA4（细胞毒性（细胞毒性T淋巴细胞抗原淋巴细胞抗原4）位于）位于T细细胞表面，为胞表面，为B7受体，与受体，与B7的亲和力是的亲和力是CD28的的

36、20倍。倍。 CD28与与CTLA4的功能有着明显的差别：在有第的功能有着明显的差别：在有第一信号存在的情况下，一信号存在的情况下，B7与与CD28结合后，共刺结合后，共刺激信号传递给激信号传递给T细胞，产生正常的免疫应答；而细胞，产生正常的免疫应答；而B7与与CTLA4结合后，则对结合后，则对T细胞的免疫应答起负细胞的免疫应答起负性调节作用。性调节作用。 CTLA4-Ig是由人是由人CTLA4分子的胞外区，与人的分子的胞外区，与人的IgG1的恒定区的恒定区CH2和和CH3区融合而成的可溶性嵌区融合而成的可溶性嵌合蛋白，可与人合蛋白，可与人/大鼠大鼠/小鼠的小鼠的B7分子结合。分子结合。 CT

37、LA4-Ig是一种高效是一种高效/无毒并兼有免疫抑制和诱导无毒并兼有免疫抑制和诱导免疫耐受的生物免疫抑制剂，对移植排斥的防治免疫耐受的生物免疫抑制剂，对移植排斥的防治和一些自身免疫疾病的治疗具有广阔的应用前景。和一些自身免疫疾病的治疗具有广阔的应用前景。第五节第五节 抗体工程抗体工程 抗体研究的沿革抗体研究的沿革多克隆抗体多克隆抗体 18901890年年19751975年，是用抗原免疫动物，年，是用抗原免疫动物，获得多克隆抗体获得多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 19751975年年20C 90Y20C 90Y，以杂交瘤技术制备，以杂交瘤技术制备单克隆抗体单克隆抗体以基因工程方法制备抗体以基因工

38、程方法制备抗体 基因工程技术制备；以基因工程技术制备；以19941994年年WinterWinter创建创建噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术为代表为代表 基因工程抗体基因工程抗体不用人工免疫动物和杂交瘤技不用人工免疫动物和杂交瘤技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转还利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动、植物大规模生产抗体，并在此基础上发基因动、植物大规模生产抗体，并在此基础上发展成抗体工程展成抗体工程一、噬菌体抗体库技术的基本方法一、噬菌体抗体库技术的基本方法 1.1.获取目的基因获取目的基因

39、 提取提取mRNAmRNA，经反转录，经反转录PCRPCR获取抗体某一特定基因区获取抗体某一特定基因区段（如段（如V VH H和和V VL L），抗体基因的组合形式多为单链抗体，），抗体基因的组合形式多为单链抗体，2.2.抗体库技术的载体抗体库技术的载体 目前应用最多的是噬菌粒（质粒目前应用最多的是噬菌粒（质粒- -噬菌体），它具噬菌体），它具有噬菌体和质粒的共同特点；转化效率高，抗体基因有噬菌体和质粒的共同特点；转化效率高，抗体基因文库容量大文库容量大3.3.淘筛淘筛 抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容

40、量次后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增4.4.表达与鉴定表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后，导入感受态菌株，进行目的克隆经过鉴定后，导入感受态菌株，进行可溶性表达，可溶性表达，其产物用其产物用western blot分析确定后，分析确定后，就完成了全过程就完成了全过程 二、噬菌体抗体库的分类二、噬菌体抗体库的分类（一）按抗体基因的性质分（一）按抗体基因的性质分1. 1. DNADNA文库文库2. 2. cDNAcDNA文库文库 （二）

41、按抗体基因的来源分（二）按抗体基因的来源分1 1天然抗体库天然抗体库( (native antibody library)native antibody library)2 2免疫抗体库免疫抗体库3 3半合成抗体库半合成抗体库 4 4全合成抗体库全合成抗体库 三、噬菌体抗体库技术的特点三、噬菌体抗体库技术的特点 1.1.模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到抗体文库可以达到10101111库容，可包含库容，可包含B B细胞的全部细胞的全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的的淋巴细胞提取的mRNAmRNA反

42、转录形成的反转录形成的cDNAcDNA扩增，这是扩增，这是人体多克隆细胞的总人体多克隆细胞的总mRNAmRNA ，抗体的，抗体的V VH H和和V VL L 基因进行基因进行随机重组也增加了抗体的多样性。因此，能模拟天然随机重组也增加了抗体的多样性。因此，能模拟天然全套抗体库全套抗体库2.2.避开了人工免疫和杂交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术 由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，可以由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，可以“挑出挑出”任意的抗体基因，因而免除了人工免疫和细任意的抗体基因，因而免除了人工免疫和细胞融合胞融合3.3.可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体 在噬菌体抗

43、体库技术中，在噬菌体抗体库技术中， V VH H和和V VL L基因的随机重组基因的随机重组模拟了体内抗体亲合力成熟的过程，所用的抗体基因模拟了体内抗体亲合力成熟的过程，所用的抗体基因又都来自人体，因此所产生的抗体必然都是高亲合力又都来自人体，因此所产生的抗体必然都是高亲合力的人源化抗体的人源化抗体四、基因工程抗体的表达四、基因工程抗体的表达 1.1.原核生物原核生物 融合表达和分泌表达融合表达和分泌表达2.2.真核生物真核生物 如酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细如酵母、昆虫细胞、中国仓鼠卵细胞等，都是分泌表达胞等，都是分泌表达3.3.转基因植物转基因植物 烟草叶中的表达（植物抗体）烟草叶中的表达

44、（植物抗体）4.4.转基因动物转基因动物 单基因水平，还处于研发阶段单基因水平，还处于研发阶段 五、五、 噬菌体表面展示文库技术的要点噬菌体表面展示文库技术的要点: : 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N N端端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3g3或或g8 g8 的先导系列的紧靠下游的先导系列的紧靠下游随机克隆入相应载体形成组合文库随机克隆入相应载体形成组合文库从免疫或未被免疫的从免疫或未被免疫的B B细胞中细胞中PCRPCR扩增抗体全套基因片段扩增抗体全套基因片段用固相化抗原经用固相

45、化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增亲和结合一洗脱一扩增”数个循环数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。和力强的抗体噬菌体库。使翻译出的抗体分泌到细菌的周质腔内，形成游离的使翻译出的抗体分泌到细菌的周质腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。筛选到的噬菌体再将基因筛选到的噬菌体再将基因g3g3或或g8g8切除后，转入大肠切除后，转入大肠杆菌，杆菌， 六、基因工程抗体的表达六、基因工程抗体的表达1、原核细胞表达：融合表达，分泌表达。、原核细胞表达：融合表达，分泌表达。2、

46、真核细胞表达：酵母，昆虫细胞，、真核细胞表达：酵母，昆虫细胞，CHO，真菌等，真菌等3、转基因植物表达：烟草，拟南芥、转基因植物表达：烟草，拟南芥4、转基因动物表达：转基因鼠转基因动物表达：转基因鼠 可不经过免疫，利用抗原从库中直接筛选出特异可不经过免疫，利用抗原从库中直接筛选出特异性抗体，获得抗体的时间短，可大量生产，特别是性抗体，获得抗体的时间短，可大量生产，特别是能直接获得人源化抗体。能直接获得人源化抗体。用用SCIDSCID小鼠制备人单抗小鼠制备人单抗SCIDSCID小鼠小鼠移植入人淋巴细胞移植入人淋巴细胞 （人鼠嵌合模型）（人鼠嵌合模型）抗原免疫抗原免疫杂交瘤技术杂交瘤技术基因工程基

47、因工程人单抗人单抗人抗体鼠人抗体鼠将小鼠将小鼠IgIg基因灭活，然基因灭活，然后转入人后转入人IgIg基因，生产出人单抗基因，生产出人单抗遗传工程鼠遗传工程鼠基因工程抗体真核细胞高效表达流程图基因工程抗体真核细胞高效表达流程图第六节第六节 抗体诊断试剂抗体诊断试剂 抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种反应。在反应。在体内体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，可作为药物用于治疗；在等作用，可作为药物用于治疗；在体外体外可发生凝集或沉淀可发生凝集或沉淀等反应，可用已知抗体来鉴定抗原，作病原学的

48、诊断和血等反应，可用已知抗体来鉴定抗原，作病原学的诊断和血型测定，成为血清学鉴定。主要有三大类抗体诊断用药型测定，成为血清学鉴定。主要有三大类抗体诊断用药（习惯上将体外试验用的称为试剂，体内导向诊断用的称（习惯上将体外试验用的称为试剂，体内导向诊断用的称为药物）为药物） 概概 况况u免疫学的迅速发展使诊断技术不断更新，抗体用于免疫学的迅速发展使诊断技术不断更新，抗体用于诊断，体现在三类诊断药物中：诊断，体现在三类诊断药物中： 血清学诊断中使用的抗体制剂血清学诊断中使用的抗体制剂 ( (体外诊断体外诊断) ) 免疫标记用的抗体制剂免疫标记用的抗体制剂 ( (体外诊断体外诊断) ) 体内导向诊断的

49、抗体药物体内导向诊断的抗体药物 ( (体内诊断体内诊断) )一、血清学鉴定用的抗体类试剂一、血清学鉴定用的抗体类试剂 血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用凝集反应用于疾病的病原菌的诊断和血型鉴定。常用凝集反应 此类诊断血清是临床病原菌诊断的有力工具，是诊断试此类诊断血清是临床病原菌诊断的有力工具，是诊断试剂中重要的一类试剂。若用单克隆抗体还可以检测出多种病剂中重要的一类试剂。若用单克隆抗体还可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异毒中非常细微的株间差异 ，鉴定细菌的种型和亚种，这是，鉴定细菌的种型和

50、亚种，这是传统血清法或动物免疫法所做不到的，而且诊断异常准确传统血清法或动物免疫法所做不到的，而且诊断异常准确 （1 1）常用诊断血清的品种和用途）常用诊断血清的品种和用途（表（表4-64-6）如：血液分型血清如：血液分型血清血型检测血型检测 沙门氏菌诊断血清沙门氏菌诊断血清肠道病原菌（如伤寒、副伤寒杆菌）肠道病原菌（如伤寒、副伤寒杆菌） 志贺氏菌诊断血清志贺氏菌诊断血清细菌性痢疾病原菌细菌性痢疾病原菌 大肠杆菌诊断血清大肠杆菌诊断血清大肠杆菌大肠杆菌（2 2）诊断血清的制备）诊断血清的制备 制备细菌抗原制备细菌抗原 免疫动物免疫动物 制备抗体血清制备抗体血清（3 3）诊断血清诊断方法）诊断血

51、清诊断方法直接凝集反应：直接凝集反应：向细菌、红细胞等颗粒性抗原中加入相应抗体后，在有向细菌、红细胞等颗粒性抗原中加入相应抗体后，在有适量电解质存在下，能形成肉眼可见的凝块（常用玻片法做定性试验）适量电解质存在下，能形成肉眼可见的凝块（常用玻片法做定性试验） 1.1.鉴定病原菌的抗体试剂鉴定病原菌的抗体试剂2.2.乙型肝炎病毒表面抗原（乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反的反向被动血凝诊断试剂向被动血凝诊断试剂 （1 1）检测方法：）检测方法：早期检测早期检测HBsAgHBsAg曾用双向琼脂扩散法和对流电泳法；但曾用双向琼脂扩散法和对流电泳法；但由于敏感度不高而被卫生部禁用。现在运用由于敏感

52、度不高而被卫生部禁用。现在运用反向被动血凝试验（反向被动血凝试验（RPHARPHA）进行检测进行检测（2 2）检测原理：）检测原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗乙肝病毒血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中有当纯化的抗乙肝病毒血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中有乙型肝炎病毒表面抗原时，则发生特异性结合反应而使血细胞发生凝集乙型肝炎病毒表面抗原时，则发生特异性结合反应而使血细胞发生凝集 （3 3）方法特点：）方法特点：用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原，其灵敏用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原，其灵敏度

53、高、操作简单、快速、价廉、不需特殊设备，已被广泛用于乙肝病例度高、操作简单、快速、价廉、不需特殊设备，已被广泛用于乙肝病例检测检测（4 4）制剂方法：）制剂方法：先用先用HBsAgHBsAg免疫豚鼠，获得抗免疫豚鼠，获得抗- HBsAg- HBsAg血清，经（血清，经（NHNH4 4）2 2S0S04 4盐析及盐析及DEAE-SephadexDEAE-Sephadex柱层析，取其柱层析，取其IgG,IgG,再将新鲜再将新鲜O O型红细胞用丙酮型红细胞用丙酮和甲醛处理，然后用纯化的抗和甲醛处理，然后用纯化的抗- HBsAg- HBsAg血清于血清于pH4.0pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛醋酸缓冲液

54、中致敏醛化血细胞，洗去多余的蛋白质成分，用含化血细胞，洗去多余的蛋白质成分，用含1%1%兔血清的稀释液稀释至一定兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成浓度，分装即成3.3.妊娠诊断试剂妊娠诊断试剂 妊娠后，血液和尿液中的绒毛膜促性腺激素（妊娠后，血液和尿液中的绒毛膜促性腺激素（HCGHCG）含量增高，在三个月内达到高峰。测定方法有生物试含量增高，在三个月内达到高峰。测定方法有生物试验法、验法、胶乳间接凝集试验法胶乳间接凝集试验法、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法放射免疫测定法 胶乳间接凝集法：胶乳间接凝集法：胶乳中加入胶乳中加入HCGHCG致敏（试剂为胶致敏（试剂为胶 乳

55、和抗乳和抗-HCG-HCG血清）血清） 胶乳直接凝集法：胶乳直接凝集法：胶乳中加入胶乳中加入HCGHCG抗体致敏（试剂抗体致敏（试剂 只用胶乳）只用胶乳） 血型有多个系统，其中最重要的是血型有多个系统，其中最重要的是ABO血型系统血型系统，按人红细胞表面带有的，按人红细胞表面带有的A或或B种凝集原来分型。种凝集原来分型。4.4.抗抗ABOABO血型系统血清血型系统血清 ABOABO血型抗血清的制备血型抗血清的制备人源性人源性ABOABO血型抗血清是采集健康献血人的血液，凝固后，置血型抗血清是采集健康献血人的血液，凝固后，置44过过夜，使非特异性抗体吸附在血块上一起除掉；然后分离血清，加入叠夜，

56、使非特异性抗体吸附在血块上一起除掉；然后分离血清，加入叠氮钠防腐，氮钠防腐，56 30min56 30min灭能，使补体等活性丧失；在抗灭能，使补体等活性丧失；在抗A A血清中加入血清中加入美蓝，在抗美蓝，在抗B B血清中加入复红，以资区别，分装保存血清中加入复红，以资区别，分装保存动物源性动物源性ABOABO血型抗血清是用人血型物质血型抗血清是用人血型物质A A和和B B免疫马得到的抗体血免疫马得到的抗体血清，然后用清，然后用O O型红细胞吸附去掉非特异性抗体，再加型红细胞吸附去掉非特异性抗体，再加防腐剂，除菌过防腐剂，除菌过滤，分装滤，分装单克隆抗体是应用单克隆抗体是应用B B淋巴细胞杂交

57、瘤技术生产抗淋巴细胞杂交瘤技术生产抗A A或抗或抗B B血清（但由血清（但由于于单克隆抗体单克隆抗体特异性极高，而血型物质较复杂，易得到假阴性结果）特异性极高，而血型物质较复杂，易得到假阴性结果） 二、免疫标记技术用的抗体类试剂二、免疫标记技术用的抗体类试剂 对于常规方法不能观察的对于常规方法不能观察的Ag-AbAg-Ab反应，可用放射性核素、反应，可用放射性核素、荧光素或酶对抗体标记的方法，将荧光素或酶对抗体标记的方法，将Ag-AbAg-Ab反应放大，提高反反应放大，提高反应的敏感性，可对微量抗原物质进行定性或定量检测。应的敏感性，可对微量抗原物质进行定性或定量检测。（一）荧光抗体诊断试剂（

58、一）荧光抗体诊断试剂 用荧光色素标记抗体，当抗原与抗体反应时可发出荧用荧光色素标记抗体，当抗原与抗体反应时可发出荧光。可用于定性或定量光。可用于定性或定量（二）放射免疫用抗体诊断试剂（二）放射免疫用抗体诊断试剂 用放射性核素（如用放射性核素（如125125I I）标记抗体，制备成抗体诊断试）标记抗体，制备成抗体诊断试剂。此法具有剂。此法具有放射性核素分析的放射性核素分析的高度灵敏性和抗原抗体反高度灵敏性和抗原抗体反应的特异性两大特点应的特异性两大特点 （一）荧光抗体诊断试剂免疫荧光技术：免疫荧光技术： 用异硫氰酸荧光素用异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate,

59、FITC)、罗丹明、罗丹明 (Rhodamine)或藻或藻红素等荧光色素标记抗体，直接向组织切片或细胞红素等荧光色素标记抗体，直接向组织切片或细胞悬液滴染，在悬液滴染，在荧光显微镜荧光显微镜下或用下或用流式分光光度计（流式分光光度计（流式细胞仪）流式细胞仪）观察。观察。荧光抗体的制备荧光抗体的制备免疫荧光测定方法免疫荧光测定方法（1 1）直接法：采用荧光抗体直接与抗原反应。优点：）直接法：采用荧光抗体直接与抗原反应。优点：特异性高；缺点：每种抗原须单独制备相应的荧特异性高；缺点：每种抗原须单独制备相应的荧光抗体。光抗体。（2 2）简接法：用）简接法：用荧光标记抗球蛋白抗体荧光标记抗球蛋白抗体（

60、荧光第二抗（荧光第二抗体）来检测未知抗原。只需制备一种荧光标记的体）来检测未知抗原。只需制备一种荧光标记的抗体，即可用以检测多种抗原抗体系统，敏感度抗体，即可用以检测多种抗原抗体系统，敏感度比直接法高比直接法高5 51010倍。倍。免疫荧光（神经元）免疫荧光显像系统（二）免疫酶抗体诊断试剂 用酶标记来检测抗原，分为免疫酶染色（组比法）用酶标记来检测抗原，分为免疫酶染色（组比法）和酶免疫测定两种类型。和酶免疫测定两种类型。 免疫酶染色法用酶标记抗体，称为酶标抗体。测定免疫酶染色法用酶标记抗体，称为酶标抗体。测定时酶标抗体与抗原发生特异性结合，发生组化反应时酶标抗体与抗原发生特异性结合，发生组化反