第14章 全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪教学指导

1、第十四章 全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪首 页基本要求重点难点讲授学时内容提要1基本要求 了 解(1全自动DNA测序仪的仪器结构(2全自动DNA测序仪各组成部分的功能(3全自动DNA测序仪的进展(4蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能(5蛋白质测序仪的主要应用1.2 熟 悉(1荧光标记DNA的检测原理(2全自动DNA测序仪的常见故障及维护(3全自动DNA测序仪的主要应用1.3 掌 握(1双脱氧链末端终止法测序原理(2荧光标记引物法定义及特点(3荧光标记终止底物法定义及特点(4荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点(5蛋白质测序仪的工作原理2重点难点 重 点(1双脱氧链末端终止法测序原理

2、(2荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的定义及两者的异同点(3蛋白质测序仪的工作原理2.2 难点(1荧光标记DNA的检测原理(2全自动DNA测序仪的结构及仪器各组成部分的功能(3全自动DNA测序仪的常见故障及维护3讲授学时 建议2学时4学时4内容提要 4.1.1 全自动DNA测序仪的工作原理DNA测序是指检测其一级结构-核苷酸的线性排列顺序。目前DNA测序仪的工作原理主要是利用Sanger双脱氧链末端终止法或Maxam-Gilbert化学降解法。双脱氧链末端终止法测序原理：是利用DNA的体外合成过程聚合酶链反应（PCR）。反应体系中除加入4种dNTP外，还加入一种，-双脱氧核苷三磷酸（,-dd

3、NTP，N代表A、C、G、T任一碱基）。与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。通过聚丙烯

4、酰胺凝胶电泳对长度不等的新生链进行分离后，就可根据片段大小直接读出新生DNA链的序列。新生链的荧光标记：(1多色荧光标记法 多色荧光标记法的荧光染料掺入方式有两种。第一种方式是将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的端，称为荧光标记引物法。第二种掺入方式是将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上，称为荧光标记终止底物法。 表示5端带有不同荧光染料的引物 、 、 、 表示标记不同颜色荧光染料的ddNTP图18-1 荧光标记引物法化学原理 图18-2 荧光标记终止底物法化学原理此两种方法都确定了4种荧光染料与4种双脱氧核苷酸所终止的DNA片段之间的专一对应关系。两种掺入方式的区别在于，荧光标记

5、引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端，可以理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔。而荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成。在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而后者的四种反应可以在同一管中完成。(3 单色荧光标记法 也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法两种。与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳。荧光标记D

6、NA的检测原理：测序反应产物加入测序仪后，两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正极泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口。由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段。DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光。这种代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。经计算机软件分析后显示测序结果。整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信号数据的集合。经测序分析软件对这些原始数据进

7、行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来。4.1.2 全自动DNA测序仪的结构与功能目前使用的全自动DNA测序仪都是通过凝胶电泳技术进行DNA片段的分离。根据电泳方式的不同又分为平板型电泳和毛细管电泳两种仪器类型。平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳。毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中（内径50m100m），在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离。不同类型全自动DNA测序仪的外观有所差异，但基本结构大致相同，主要由主机、微型计算机和各种应用软件等组成。主机主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系统等。

8、大致可分为以下几个结构功能区：(1自动进样器区 装载有样品盘、电极（负极）、电极缓冲液瓶、洗涤液（蒸馏水）瓶和废液管。(2凝胶块区 凝胶块区包括注射器驱动杆、样品盘按钮、注射器固定平台、电极（正极）、缓冲液阀、玻璃注射器、毛细管固定螺母和废液阀等部件。(3检测区 检测区内有 激光检测器窗口及窗盖、加热板、毛细管、热敏胶带。 仪器各组成部分的功能(1主机功能 主机具有自动灌胶、进样、电泳、荧光检测等功能。自动进样器区功能 自动进样器受程序控制进行三维移动，许多操作如毛细管进入样品盘标本孔中进样、电极和毛细管在电极缓冲液瓶、洗涤液和废液管中移动等均依靠自动进样器的移动完成；电极为电泳的负性电极，测

9、序过程中，正、负极之间的电势差可达15000伏，如此高的电势差可促进DNA分子在毛细管中很快泳动，达到快速分离不同长度DNA片段的目的；样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48或96个样本；电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用。凝胶块区功能 注射器驱动杆：给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中；样品盘按钮：控制自动进样器进出；注射器固定平台：起固定注射器的作用；电极：为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲液中；正极缓冲液阀：当注射器驱动杆下移，将注射器内的凝胶压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防止胶进入缓冲液；电泳时此阀打开，提供电流通道；玻璃注射器：储存凝胶高分子聚合物以及在填充

10、毛细管时提供必要的压力；毛细管固定螺母：固定毛细管；废液阀：在清洗泵块时控制废液流。检测区功能 激光检测器窗口及窗盖：从仪器内部的氩离子激光器发出的激光可通过激光检测器窗口照到毛细管检测窗口上。电泳过程中，当荧光标记DNA链上的荧光基团通过毛细管窗口时，受到激光的激发而产生特征性的荧光光谱，荧光经分光光栅分光后投射到CCD摄像机上同步成像。窗盖起固定毛细管的作用，同时可防止激光外泄；加热板：电泳过程中起加热毛细管的作用，一般维持在50；毛细管：为填充有凝胶高分子聚合物的玻璃管，直径为50m，电泳时样品在毛细管内从负极向正极泳动；热敏胶带：将毛细管固定在加热板上。(2微型计算机功能 控制主机的运

11、行，并对来自主机的数据进行收集和分析。(3各类软件功能 承担数据收集、DNA序列分析及DNA片段大小和定量分析等功能。4.1.3 全自动DNA测序仪的常见故障及维护毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障包括电泳时仪器显示无电流、电极弯曲、电泳时产生电弧等.(1 电泳时仪器显示无电流 最常见的原因是由于电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管的两端（或一端）。(2 电极弯曲 主要原因是安装、调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执行电泳命令，电极不能准确插入各管中而被样品盘打弯。(3 电泳时产生电弧 主要原因是电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积，此时应立即停机，并清洗电极、加热板或自动进样器

12、。 (4 其他 测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避免凝胶干燥而阻塞毛细管。定期清洗泵块，定期更换电极缓冲液、洗涤液和废液管。平板电泳型DNA测序仪的常见故障包括电泳时仪器显示无电流、传热板粘住胶板及其他。(1 电泳时仪器显示无电流 可能原因包括：电泳缓冲液配制不正确；电极导线未接好或损坏；正极或负极铂金丝断裂；正极或负极的胶面未浸入缓冲液中。(2 传热板粘住胶板 主要原因为上方的缓冲液室漏液。此时应将上方的缓冲液倒掉，并卸下缓冲液室，松开胶板固定夹，将传热板顺着胶板向上滑动，直至与胶板分开。(3 其他 倒胶前应按照操作要求认真清洗玻璃板，用未清洗干净的胶板倒胶时易产生气泡、或者产生较高

13、的荧光背景；配制凝胶时应注意胶的浓度、TEMED含量、尿素浓度等，并注意防止其他物质（尤其是荧光物质）的污染；倒胶时需注意不能有气泡，用固定夹固定胶板时，四周的力度应均匀一致；将待测样品加入各孔前，应使用缓冲液冲洗各孔，把尿素冲去，以免影响电泳效果。4.1.4 全自动DNA测序仪的进展Smith等于1986年首次建立了一种使用四种不同荧光分别标记四种不同碱基的方法。反应后在同一电泳管中电泳，通过激光作用诱发荧光并检测。然而因不同的荧光染料有不同的电泳迁移率，使得各种染料标记的碱基吸收光谱出现重叠现象，增加了结果判读的复杂性。同年，Ansorge建立了一种使用单色荧光四甲基罗丹明作为标记染料的自

14、动测序方法。该系统采用激光装置激发荧光，并有相应的荧光信号接收装置，可以将荧光信号转换成电信号输入到数据处理系统中，直接得到待测的序列数据。随着应用的日益广泛，荧光标记的自动测序系统也逐渐完善。尤其是四色荧光全自动测序系统的发展，进一步提高了检测的自动化水平。目前使用的全自动DNA测序仪包括平板型电泳和毛细管电泳两种仪器类型。平板法电泳是经典的电泳技术，具有样品判读序列长（600bp900bp）、一块凝胶板上可同时进行多个样品测序（可达96个）的优点。毛细管电泳为近20年来建立的一种快速、高效、进样量少、灵敏度高的新技术，可测序列达到750bp左右。随着应用的日益广泛，荧光标记的自动测序系统也

15、逐渐完善。尤其是四色荧光全自动测序系统的发展，进一步提高了检测的自动化水平。4.1.5 全自动DNA测序仪的主要应用全自动DNA测序仪主要应用在人类基因组测序；人类遗传病、传染病和癌症的基因诊断；法医的亲子鉴定和个体识别；生物工程药物的筛选；动植物杂交育种等方面。4.2 蛋白质自动测序仪4.2.1 蛋白质测序仪的工作原理蛋白质测序仪主要检测蛋白质的一级结构，即肽链中的氨基酸序列，其原理沿用Edman降解法。目前的蛋白质测序仪实际上是执行全自动化的Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定过程。在弱碱条件下，多肽链N末端NH2与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，生成PTC多肽。这一反应在4548

16、进行约15min并用过量的试剂使有机反应完全。在无水强酸如三氟醋酸（TFA）的作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽链断裂形成噻唑啉酮苯胺（ATZ）衍生物和一个失去末端氨基酸的剩余多肽。剩余多肽链可以进行下一次以及后续的降解循环。如此不断循环，可依次使多肽链的氨基酸逐一降解，形成ATZ衍生物。ATZ衍生物经水溶酸处理转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH氨基酸）。上述降解循环的偶联和环化发生在测序仪的反应器（筒）中，转化则在转化器进行。转化后的PTH氨基酸经自动进样器注入高效液相色谱(HPLC进行在线检测。根据PTH氨基酸的洗涤滞流时间确定每一种氨基酸。4.2.2 蛋白质测序仪的结构及其各部

17、件的功能(1测序反应系统 测序反应系统的主要部件为反应器。因为反应条件要求一定的温度、时间、液体流量等，所以系统计算机具备调节控制这些因素，能够离人，甚至遥控操作。蛋白质或多肽在这里被水解为单个氨基酸残基。(2氨基酸分析系统 氨基酸分析系统是由十分精致的高效液相色谱毛细管层析柱组成，层析是整个测序最为关键的一步，液体分配速度、温度、电流电压都能影响层析结果。所以仪器配有稳压、稳流、自动分配流速装置。氨基酸通过这一系统会留下自己的特征吸收峰。(3信息软件处理系统 测序软件是根据氨基酸的层析峰来判断为何种氨基酸。计算机系统同DNA测序系统一样直观、易于操作，它提供测序需要的运行参数。时间，温度，电压和其他的循环状况，并可实现跳跃步骤，暂停步骤。以上为测序仪的主要部件，在主件之外尚有蛋白质或多肽的纯化处理配件及整个测序必备的试剂和溶液。4.3.3 蛋白质测序仪的主要应用(1新蛋白质的鉴定 在凝胶电泳中出现的未知条带可以