环境样品前处理衍生化实用教案

1、过程(guchng)：化学反应定量转化适于分析。定义：借助化学反应将待测组份接上某种特定基团，从而(cng r)改善其检测灵敏度和分离效果的方法。 作用：把难于分析的物质转化为易于分析的物质，通过对反应产物的检测间接分析目标化合物。 第1页/共56页第一页，共57页。1. 柱前衍生化：衍生化反应定量生成色谱(s p)分析。2. 柱后衍生化：色谱(s p)柱分离衍生化反应检测。分类：柱前衍生(yn shn)化和柱后衍生(yn shn)化。 流程：第2页/共56页第二页，共57页。柱前衍生柱前衍生(yn (yn shn)shn)化化柱后衍生柱后衍生(yn (yn shn)shn)化化分离(fnl)

2、-衍生产物检测-衍生产物检测-衍生产物分离-待测物本体待测物本体衍生化第3页/共56页第三页，共57页。 提高目标物可检测性：提高目标物可检测性： LC: LC:提高检测灵敏度与选择性提高检测灵敏度与选择性 GC: GC:改善色谱分离，通过增强目标物挥发性改善色谱分离，通过增强目标物挥发性或者改善目标物极性或者改善目标物极性 提高理化稳定性提高理化稳定性 为结构鉴定提供为结构鉴定提供(tgng)(tgng)依据依据第4页/共56页第四页，共57页。1.柱前衍生化反应需满足的条件：2. 反应迅速(xn s)、定量、重复、条件不苛刻、易操作；3. 选择性高、具有专一性；4. 反应产物只有一种，无干

3、扰；5. 衍生化试剂易得、通用性好。第5页/共56页第五页，共57页。2. 柱后衍生化反应(fnyng)需满足的条件： 反应(fnyng)迅速、定量、重复； 反应(fnyng)条件与色谱条件适应； 反应(fnyng)产物可检测； 第6页/共56页第六页，共57页。（ 1 1 ） 硅 烷 化 衍 生 化 方 法） 硅 烷 化 衍 生 化 方 法(fngf)(fngf)（ 2 2 ） 酯 化 衍 生 化 方 法） 酯 化 衍 生 化 方 法(fngf)(fngf)（ 3 3 ） 卤 化 衍 生 化 方 法） 卤 化 衍 生 化 方 法(fngf)(fngf)（ 4 4 ） 酰 化 衍 生 化 方

4、法） 酰 化 衍 生 化 方 法(fngf)(fngf)方法方法(fng(fngf)f)第7页/共56页第七页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章质子性化合物如醇、酚、酸、胺等与硅烷质子性化合物如醇、酚、酸、胺等与硅烷化试剂反应化试剂反应(fnyng)(fnyng)，形成挥发性的硅烷，形成挥发性的硅烷衍生物衍生物R R3 3SiSiX + X + + H + HX XP135表6-1第8页/共56页第八页，共57页。大多数有机酸挥发性、热稳定性差。在GC分析(fnx)之前衍生为相应的酯。 甲醇(ji chn)法 重氮甲烷法 三氟乙酸酐法 酯化反应第9页/共56页第九页，共5

5、7页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章甲醇甲醇(ji chn)(ji chn)法：有机酸与甲醇法：有机酸与甲醇(ji chn)(ji chn)在催化剂的存在下加热，可以发生酯化反应，在催化剂的存在下加热，可以发生酯化反应，生成有机酸甲酯生成有机酸甲酯RCOOH + RCOOH + 催化剂催化剂 + H + H2 2O O 硫酸、盐酸-加热 室温催化剂第10页/共56页第十页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章非水介质(jizh)中CH2N2与有机酸反应，生成有机酸甲酯RCOOH + RCOOH + + N + N2 2重氮甲烷不稳定，有爆炸性，有毒！第11页/共

6、56页第十一页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章醇或酚与有机酸反应(fnyng)，生成酯：RCOOH + ROHRCOOR +H2O适合(shh)空间位阻较大的化合物。三氟乙酸酐第12页/共56页第十二页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章 在在-OH、-SH、-NH等含有活泼氢的化合物上引入酰基等含有活泼氢的化合物上引入酰基转化为弱极性的酯、硫酯或酰胺转化为弱极性的酯、硫酯或酰胺改善挥发性和稳定性，改善挥发性和稳定性，含有卤离子的羰基基团可增强含有卤离子的羰基基团可增强ECD响应。响应。 优点：优点： 保护不稳定基团；保护不稳定基团； 提高糖类，氨基

7、酸等物质的挥发性和热稳性；提高糖类，氨基酸等物质的挥发性和热稳性； 有助于混合物分离；有助于混合物分离； 使用使用ECD检测，分析物检测下限检测，分析物检测下限(xixin)可降低很多。可降低很多。 第13页/共56页第十三页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章（1）乙酰化法：提高挥发性试剂：乙酸酐（AA）样品(yngpn)：糖类介质：多为非水催化剂：吡啶等碱性化合物第14页/共56页第十四页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章（2）多氟酰化法：引入卤素！试剂：三氟乙酸酐（TFA）、五氟丙酸酐（PFP）、七氟丁酸酐（HFB）、N-甲基双（三氟乙酸酐）咪唑

8、（MBTFA）、1-(三氟乙酰)咪唑（TFAI） 样品：药物(yow)等大分子介质：非水第15页/共56页第十五页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章 引入卤素(l s)ECD检测器改善挥发性和稳定性。（1）卤素法：加成加成或取代取代 第16页/共56页第十六页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章（2）卤化(l hu)氢法：加成或置换 （3）NBS法：烯丙位取代烯丙位取代 P137 第17页/共56页第十七页，共57页。HPLC化学衍生化分类 在线化学衍生化 是否与HPLC系统(xtng)联机 离线化学衍生化 柱前衍生化 发生衍生化发应的先后 柱后衍生化

9、第18页/共56页第十八页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章1. 1. 紫外衍生紫外衍生(yn shn)(yn shn)化反应化反应2 2荧光衍生化反应荧光衍生化反应 3 3电化学衍生化反应电化学衍生化反应第19页/共56页第十九页，共57页。优点：（1）对用作流动相的溶剂体系没有限制；（2）反应条件，反应速率不受限制； （3）通过(tnggu)选择合适的试剂以及萃取方法，可以 消除许多干扰；（4）过量溶剂、试剂容易除去；（5）转变成合适的衍生物，可使分离度改进。第20页/共56页第二十页，共57页。缺点(qudin):（1）操作过程繁琐，容易影响定量准确性。（2）当一个

10、复杂组分样品经过衍生化反应 后，有可能产生多种衍生化产物给色 谱分离带来困难。 第21页/共56页第二十一页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章 液相色谱法中，紫外吸收检测器是最常见的一种高灵敏度检测器 很多化合物在紫外可见光谱区无吸收 与带有紫外吸收基团的衍生试剂在一定条件下发生(fshng)反应，反应产物带有发色基团而能被紫外吸收检测器检测。第22页/共56页第二十二页，共57页。本节首页本节首页 退出退出(tuch)本章本章 + 胺、醇、酚类衍生物（ ）第23页/共56页第二十三页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章第24页/共56页第二十四页，共

11、57页。定义：用含有芳香环或杂环的大基团取代被测化合物分子(fnz)中的一个或几个原子，以此将荧光物标记入分子(fnz)，此时被测分子(fnz)的结构基本不变特点：高选择性、高灵敏度荧光检测器灵敏度比紫外检测器的灵敏度高10到1000倍 第25页/共56页第二十五页，共57页。第26页/共56页第二十六页，共57页。 2 2、半胱氨酸结构式：半胱氨酸结构式：1、福多司坦结构式、福多司坦结构式: : 结 构 特 点 3、结构特点、结构特点(tdin)：为半胱氨酸衍生物；为半胱氨酸衍生物； 没有强的紫外吸收，没有强的紫外吸收， 没有荧光；没有荧光； 分子量小，极性大。分子量小，极性大。羧基羧基(s

12、u j)伯氨基伯氨基第27页/共56页第二十七页，共57页。衍生衍生(yn shn)化产物化产物的激发波长为的激发波长为338 nm，发射波长为发射波长为450 nm反应反应(fnyng)(fnyng)过程：过程： 参考参考(cnko)(cnko)氨基酸的测定方法，选择合适的衍生氨基酸的测定方法，选择合适的衍生化试剂衍生化后测定：化试剂衍生化后测定：第28页/共56页第二十八页，共57页。 常用的荧光(ynggung)衍生化试剂（亦称荧光(ynggung)探针）有： 第29页/共56页第二十九页，共57页。取代(qdi)基荧光团（试剂(shj)分子母体）反应基团胆磺酰肼 DNS-H第30页/共

13、56页第三十页，共57页。荧光(ynggung)衍生化试剂亦称荧光(ynggung)探针第31页/共56页第三十一页，共57页。第32页/共56页第三十二页，共57页。第33页/共56页第三十三页，共57页。荧光(ynggung)衍生化试剂的分类：第34页/共56页第三十四页，共57页。邻苯二甲醛(ji qun) OPA4-氯-7-硝基(xio j)-2,1,3-苯并恶二唑 NBD-Cl荧光(ynggung)素异硫氰酸酯FITCFMOC芴代甲氧基酰氯 6-氨喹啉基琥珀酰亚胺碳酸酯AQC第35页/共56页第三十五页，共57页。羰基(tn j)氯类： FMOC, CEOC磺酰氯类: DNs-Cl卤

14、代三嗪类: EDTN 1-乙氧基-4-(二氯-三嗪)萘（EDTN）第36页/共56页第三十六页，共57页。 肼类 DNs-HCEOC-H DNs-HCEOC-H 氨基(nj)(nj)类 氨基(nj)(nj)甲基芘 第37页/共56页第三十七页，共57页。 溴甲基类 BrMMC 哌嗪(pai qn)基类 DBD-Pz7-N-哌嗪(pai qn)-4-二甲氨基苯并呋喃(4-溴甲基-7-甲氧基香豆素)第38页/共56页第三十八页，共57页。 重氮甲烷(ji wn)基类 ADAM 其它类 9-(2-9-(2-羟乙基)-)-吖啶( dn)( dn)酮 HEAHEA4-氨甲基-6，7-二甲基香豆素 (AD

15、MC)9-蒽重氮甲烷第39页/共56页第三十九页，共57页。（3）电化学衍生化反应样品与某些(mu xi)试剂反应，生成具有电化学活性的衍生物，以便在电化学检测器上有较高的响应。环境介质对电化学反应有很大影响，如离子强度、pH值和溶剂组成等 。第40页/共56页第四十页，共57页。 常用的电化学衍生化试剂 ： （1）带硝基(xio j)的芳香化合物：P141表6-4 （2）芳氨基、酚羟基等 上述试剂与羟基、氨基、羧基、羰基(tn j)化合物反应生成具有电化学活性的衍生物。第41页/共56页第四十一页，共57页。 将样品先注入色谱柱，按选定的色谱条件使样品组分得以分离； 当各个组分从色谱柱流出后

16、，分别与衍生(yn shn)化试剂相遇，在一定的反应条件下，生成具有某种检测特性的衍生(yn shn)化产物 进入检测器测定。 第42页/共56页第四十二页，共57页。第43页/共56页第四十三页，共57页。第44页/共56页第四十四页，共57页。第45页/共56页第四十五页，共57页。（1）还原型固相反应(fnyng)剂 第46页/共56页第四十六页，共57页。6.2.4 固相化学(huxu)衍生化 酶是一种(y zhn)具有特殊三度空间构象的蛋白质，能够催化某一底物进行特异性化学反应，生成特定的反应产物。 酶的催化反应具有高度的专一性 酶试剂通常在反应中是不消失的，可重复使用 酶的固定化可

17、分为化学和物理两种方法，化学法是指在酶和载体之间生成共价键，并保留其生物活性，而物理方法仅是吸附在固体表面。第47页/共56页第四十七页，共57页。对载体的要求：对酶应有较高的亲和力和较大的容量、易再生。一般大孔径、大表面积的载体容量大，而容量越大，固定化酶的活性越高，寿命(shumng)越长。硅球、玻璃微球、氧化铝、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和纤维素等都可以作为载体。如纤维素或葡聚糖凝胶与溴化氰反应，然后用酶处理 ：第48页/共56页第四十八页，共57页。 酶一旦被固定，其稳定性增加。 利用酶反应的专一性完成的衍生化反应，可以改变底物(d w)的化学特性，提高色谱分析的灵敏度和选择性

18、。P144图 6-3 第49页/共56页第四十九页，共57页。本节首页本节首页退出退出(tuch)本章本章第50页/共56页第五十页，共57页。 其它衍生化方法：手性衍生化 用手性试剂与外消旋体反应，在分子(fnz)内导入另一手性中心，柱前衍生反应生成一对非对映异构体，两者间无镜相关系，物理化学性质不同，可用常规的色谱分离条件进行分离。 第51页/共56页第五十一页，共57页。第52页/共56页第五十二页，共57页。 P144第53页/共56页第五十三页，共57页。作业(zuy) 1.画出柱后衍生(yn shn)流程示意图。 2.用表格形式总结气相色谱柱前衍生(yn shn)化的方法原理和化学反应式第54页/共56页第五十四页，共57页。实验课 时间：5.22，5.29，6.5下午2：20 集合地点：西门-互助巷口 学习地点：礼让街23号 单位(dnwi)：青海出入境检验检疫局，五楼第