流式细胞术之基本原理及运用

1、主要内容主要内容 一、流式细胞仪结构和原理一、流式细胞仪结构和原理 流式细胞术简介流式细胞术简介 流式细胞仪的结构组成流式细胞仪的结构组成 流式细胞仪的光信号检测流式细胞仪的光信号检测 流式分选流式分选 二、流式细胞术在生物医学中的应用二、流式细胞术在生物医学中的应用1.1 流式细胞术简介流式细胞术简介 流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。 流式细胞仪（流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技

2、术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞术的特点流式细胞术的特点 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； 检测参数：多参数；检测参数：多参数； 检测特点：单细胞水平分析；检测特点：单细胞水平分析； 检测速度：高速，最高达上万个细胞检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；秒； 检测结果：精度高、准确性好；检测结果：精度高、准确性好； 可对目标细胞进行分选；可对目标细胞进行分选；流式细胞仪的发展及商品化流式细胞仪的发展及商品化 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析固定式细胞分析-流动式流动式)； 1953 Cr

3、osland-Taylor: 鞘流系统鞘流系统(解决难题解决难题)； 1956 Coulter原理原理(血细胞计数器血细胞计数器)； 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用；分光光度计定量细胞成分和散射光应用； 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置；等设计了细胞分选的装置； 1969 Vandilla等等: 第一台荧光检测细胞计第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光鞘流聚焦、激光)； 1972 斯坦福大学斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流公司与斯坦福大学合

4、作，研制生产第一台商用流 式细胞仪式细胞仪-FACS 。 1975 Kohler和和Milstein: 单克隆抗体技术单克隆抗体技术(促进流式发展促进流式发展)。流式细胞仪的分类流式细胞仪的分类 分析型分析型流式细胞仪流式细胞仪 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。 分选型分选型流式细胞仪流式细胞仪 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。式细胞仪一般只用于分选。1.2 流式细胞

5、仪的结构组成流式细胞仪的结构组成 液流系统液流系统 流动室流动室 液流驱动系统液流驱动系统 光路系统光路系统 激发光源激发光源 光束收集系统光束收集系统 电子系统电子系统 光电转换器光电转换器 数据处理系统数据处理系统 细胞分选系统细胞分选系统 喷嘴喷嘴 电偏转板电偏转板 样本收集器样本收集器1.2.1 液流系统液流系统 鞘流技术：根据层流原理发鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。 流体动力学聚焦：稳定的液流体动力学聚焦：

6、稳定的液流从截面积较大的部分流入流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在径被约束在10-20um，避免，避免了多个细胞重叠进入检测区。了多个细胞重叠进入检测区。鞘液鞘液鞘液鞘液细胞流细胞流激光照射点激光照射点流体动力学聚焦示意图流体动力学聚焦示意图流式细胞仪液流系统示意图流式细胞仪液流系统示意图流动室流动室 流动室流动室(flow cell, flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。是流式细胞仪的核心部件。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交

7、。进样孔荧光信号激光束鞘液Sheath流动室结构图：单细胞发生器流动室结构图：单细胞发生器1.2.2 光路系统光路系统（一）（一）激发光源激发光源 ：激光器：激光器 激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 现在仪器常配有仪器选配现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器根激光器激光器激光器产生的激光波长（产生的激光波长（nm）氩离子通常产生488，514，UV(351/364)红色 氦-氖（He-Ne） 633蓝色固体488红色二极管63511（二）二）光光束束成成行行系系统统FCMFCM的的单细胞照明技术单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的

8、检测区保证样：这种椭圆形光斑的检测区保证样本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。（三）光收集系统（三）光收集系统 滤光片滤光片的组成的组成 长通滤片长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过；：只允许特定波长以上的光束通过； 短通滤片短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过；：只允许特定波长以下的光束通过； 带通滤片带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。：只允许一定波长范围内的光束通过。Long pass Short pass Band pass460 500 540SP 500LP 500BP500/50460 500 540460

9、 500 5401.2.3 电子系统电子系统 光信号电信号数字信号光信号电信号数字信号（一）（一）光电检测器光电检测器(photodetector) 光电二极管光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（光灵敏度低，测定强信号（FSC）；）； 光电倍增管光电倍增管(photomultiplier, PMT)光灵敏度高，测定弱信号（光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。PMT前向散射光前向散射光光电二极管光电二极管（二）（二）电信号两种放大方式电信号两种放大方式 由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析由于光信号比较弱，需将其等比例放大

10、，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用处理，一般信号的放大可以使用线性线性或或对数对数两种方式。两种方式。 线性线性(linear; lin) 对数对数(logarithmic; log) 一般一般FSC和和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。变异范围较大，多使用对数放大。16 通道通道(channel) 一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍倍增管，就有多少个通道：增管，就有多少个通道： 散射光通道散射光通道: FSC通道和通道和SSC通道；通道； 荧光

11、通道荧光通道 通道命名方式：通道命名方式： 以以FL(fluorescence)加数字命名，如加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。等。 以该通道接收的主要荧光素命名，如以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、通道、PE通道、通道、APC通道等。通道等。 小结：小结： 液流系统液流系统 分析型流式结构分析型流式结构 光路系统光路系统 电子系统电子系统1.3 流式细胞术光信号检测流式细胞术光信号检测 光信号的类型光信号的类型 散射光信号：散射光信号：与标记荧光素无关，与标记荧光素无关， 是细胞的固有参数。是细胞的固有参数。 前向散射光前向散射光(forward scatter, FSC)

12、; 侧向散射光侧向散射光(side scatter, SSC). 荧光信号荧光信号 自发荧光自发荧光 ：微弱：微弱 特异荧光：标记的荧光素分子发出特异荧光：标记的荧光素分子发出 的荧光，比自发荧光强很多倍。的荧光，比自发荧光强很多倍。1.3.1 散射光信号散射光信号（一）前向散射光（一）前向散射光FSC FSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在信号方向与激光束平行，偏离度一般在1 -6度范围内，度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力体积大小和活力。19（二）侧向散射光（二）侧向散射光SSC SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称

13、方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散度散射光，其信号强度反映射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化细胞内部颗粒度和精细结构的变化。（三）散射光的作用（三）散射光的作用 实验中，常利用实验中，常利用FSC和和SSC这两种参数的组合，区分不同的这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞粒细胞单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片红细胞、死细胞和碎片（三）阈值（三）阈值 Threshold 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小

14、的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。小的死细胞。 FSC反映细胞体积的大小，反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取应用时常选取FSC设定阈值。设定阈值。5%32%默认阈值默认阈值升高阈值后升高阈值后1.3.2 荧光信号荧光信号（一）荧光：（一）荧光： 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。发射波长发射波长(荧光波长荧光波长)Emission wavelength激发波长激发波长Excitation

15、 wavelength23（二）常用荧光素（二）常用荧光素499nm 蓝色荧光（蓝色荧光（Blue）； 500-549nm，绿色荧光（，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（，黄色荧光（Yellow）； 585-615nm，橙色荧光（，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（，红色荧光（Red）； 700nm，远红外荧光（，远红外荧光（Far-Red）。荧光素分子荧光素分子激发光波长激发光波长（nm）发射光波长发射光波长（nm）中文名中文名FITC490520异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素PE488575藻红蛋白藻红蛋白PerCP490675多甲藻叶绿素蛋白多甲藻

16、叶绿素蛋白APC650660别藻青蛋白别藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素5PE-Cy7496/546767藻红蛋白藻红蛋白-花青素花青素7Alexa Flour 488495519Alexa Flour 647650665（三）荧光抗体的选择（三）荧光抗体的选择A 根据流式细胞仪选择抗体根据流式细胞仪选择抗体 流式细胞仪能检测的通道数流式细胞仪能检测的通道数(由激光器种类、数量和使用由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定的光学滤片决定)。如。如PARTEC CyFlow Space 分析模块：分析模块： 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；

17、多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。 488FL1FITC、Alexa Fluor 488FL2PEFL3PIFL4PE-Cy5、PerCP640FL10APC、AF647B 根据抗原表达强弱合理选择根据抗原表达强弱合理选择抗体抗体 不同的荧光素强度有所不同；不同的荧光素强度有所不同； 高表达的抗原可用不太高表达的抗原可用不太“亮亮”的染料，更的染料，更“亮亮”的荧光素分的荧光素分配给表达低的抗原：配给表达低的抗原： CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PEC 选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进

18、行组合，选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。同时需要正确的调节补偿。CD51.5 流式分选流式分选 电荷式电荷式分选分选超声振动器超声振动器(15-100kHz)液流充电系统液流充电系统高压偏转板高压偏转板收集装置收集装置(流式管、培养板流式管、培养板)lasers断裂点断裂点(充电充电)高压偏转板高压偏转板电荷式分选装置电荷式分选装置PARTEC 分选模块分选模块PPCSPiezo HV: 400560分选指标分选指标 分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。需要收集的细胞数。需要细胞数目标细胞所占比例(%)15501041.7 min20 s2 s10516.8 min3.4 min20 s1062.8 h3.4 min3.4 min1071.2 天5.6 h34 min分选时间表分选时间表(机器流速机器流速10000个个/s时时) 分选纯度分选纯度指被