二氢黄酮醇4-还原酶基因

1、二氢黄酮醇二氢黄酮醇4 4还原酶基因还原酶基因学生：焦淑珍导师：刘雅莉2012-12-291 1 二氢黄酮醇二氢黄酮醇4 4还原酶基因的结构和作用机制还原酶基因的结构和作用机制 二氢黄酮醇二氢黄酮醇4 4还原酶（还原酶（dihydroflavonol 4dihydroflavonol 4reductasereductase，DFRDFR）属）属于于NADPH NADPH 依赖性短链还原酶家族，为单基因编码。最近鉴定了葡萄依赖性短链还原酶家族，为单基因编码。最近鉴定了葡萄（Vitis viniferaVitis vinifera）DFR DFR 的晶体结构，发现其是由的晶体结构，发现其是由3 3

2、 个亚基组成的复合物，个亚基组成的复合物， 具有专门的具有专门的NADPH NADPH 结合域。结合域。DFR DFR 是花青素生物合成途径的关键酶，是花青素生物合成途径的关键酶， 分别分别催化二氢堪非醇（催化二氢堪非醇（dihydrokaempferoldihydrokaempferol，DHKDHK）、二氢栎皮黄酮）、二氢栎皮黄酮（dihydroquercetindihydroquercetin，DHQDHQ） 和二氢杨梅黄酮（和二氢杨梅黄酮（dihydromyricetindihydromyricetin，DHMDHM）生成无色花葵素（生成无色花葵素（leucopelargonidinl

3、eucopelargonidin）、无色花青素（）、无色花青素（leucocyanidinleucocyanidin）和无色翠雀素（和无色翠雀素（leucodelphinidinleucodelphinidin），然后这些无色花青素在花色素苷合），然后这些无色花青素在花色素苷合成酶（成酶（anthocyanin synthaseanthocyanin synthase，ANSANS）和类黄酮）和类黄酮3 3O O糖基转移酶糖基转移酶（flavonoid 3flavonoid 3OglucosyltransferaseOglucosyltransferase，3GT3GT）的作用下合成各种花青素

4、。）的作用下合成各种花青素。由于由于DFR DFR 对底物的特异性和表达水平的不同，使植物呈现出各异的花色和对底物的特异性和表达水平的不同，使植物呈现出各异的花色和果色果色 DFR DFR属于属于NADPHNADPH依赖性的短链依赖性的短链DFRDFR还原酶超家族还原酶超家族 ，最早于最早于19851985年由年由O O ReillyReilly等从等从玉米玉米(Zeamays)(Zeamays)和和金鱼草金鱼草(Antirrhinum m “s)(Antirrhinum m “s)中分离出中分离出来来 。随后，。随后，BeldBeld等等 在在19891989年又以部分金鱼草年又以部分金鱼草

5、DFRDFR表型突变基因为探表型突变基因为探针针分离了矮牵牛分离了矮牵牛(Petunia hybrida)DFR(Petunia hybrida)DFR基因。至今，通过同源克隆等基因。至今，通过同源克隆等方法，已经在拟南芥方法，已经在拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Arabidopsis thaliana)、兰花、兰花(Bromheadia (Bromheadia finlaysoniana)finlaysoniana)、山茶、山茶(Camellia sinensis)(Camellia sinensis)、番茄、番茄(Lycopersiconesculentum)(Lyc

6、opersiconesculentum)和水稻和水稻(Oryza sativa)(Oryza sativa)等植物中分离了等植物中分离了DFRDFR基因。基因。20032003年年NakatsukaNakatsuka等分析了亚洲百合品种等分析了亚洲百合品种DFRDFR基因的时空表基因的时空表达模式，表明达模式，表明DFRDFR基因仅在花色素苷着色器官中表达，并且控制花器基因仅在花色素苷着色器官中表达，并且控制花器官的显色模式。官的显色模式。2 DFR2 DFR基因的分离基因的分离2000年年Aida等等 通过农杆菌介导的基因转染法将通过农杆菌介导的基因转染法将DFR基因转移到蓝猪耳中，基因转移

7、到蓝猪耳中，结果显示转化了反义基因的株系花冠变成浅蓝色，而转化了正义基因的结果显示转化了反义基因的株系花冠变成浅蓝色，而转化了正义基因的株系冠檐中的花色减少程度比冠筒的大。株系冠檐中的花色减少程度比冠筒的大。2004年年Fukusaki等等 成功利用成功利用针对针对CHS基因的基因的RNA干扰技术修饰了矮牵牛的花色，这项技术也可能适干扰技术修饰了矮牵牛的花色，这项技术也可能适用于用于DFR基因。基因。3 DFR 3 DFR 同源基因的结构同源基因的结构 不同物种中编码不同物种中编码DFR DFR 基因的核苷酸序列也存在种属特异性，其功能可基因的核苷酸序列也存在种属特异性，其功能可能发生在转录和

8、翻译阶段能发生在转录和翻译阶段。据。据GenBank GenBank 上登录的资料，裂叶牵牛上登录的资料，裂叶牵牛( I( I nil) nil) 与圆叶牵牛与圆叶牵牛( I( I purpurea) purpurea) 基因组序列都包含基因组序列都包含3 3 个个DFR DFR 基基因因: DFR-A: DFR-A、DFR-B DFR-B 与与DFR-CDFR-C，它们呈串联排列，并且都是由，它们呈串联排列，并且都是由6 6 个外显子个外显子组成，具有相同的内含子剪切位点，组成，具有相同的内含子剪切位点，DFR-B DFR-B 基因比基因比DFR-ADFR-A、DFR-C DFR-C 有更长

9、有更长的内含子序列的内含子序列; ; 矮牵牛基因组矮牵牛基因组中含有中含有3 3 个个DFR DFR 基因，分别定位在基因，分别定位在2 2、4 4、6 6 号染色体上号染色体上; ; 金鱼草、拟南芥金鱼草、拟南芥的的DFR DFR 基因由基因由6 6 个外显子组成，内含子剪个外显子组成，内含子剪切位点与牵牛花的是一致的切位点与牵牛花的是一致的; ; 高梁高梁基因组中含有基因组中含有2 2 个个DFR DFR 基因，呈串联基因，呈串联排列排列; ; 蔓越橘蔓越橘的基因组含有的基因组含有2 2 个个DFR DFR 基因，代表基因，代表2 2 个不同的座位，在编个不同的座位，在编码的氨基酸序列中，

10、码的氨基酸序列中， 24 24 个氨基酸有差异。由此可以看出，个氨基酸有差异。由此可以看出，不同种属的不同种属的DFR DFR 氨基酸序列或核苷酸序列存在一定的差异，分析氨基酸序列或核苷酸序列存在一定的差异，分析DFR DFR 同源基因的结同源基因的结构对研究其种属间的功能至关重。构对研究其种属间的功能至关重。 4 DFR 4 DFR 基因底物的特异性基因底物的特异性 DFR DFR 对底物的特异性和表达水平不同，使植物呈现出各异的花色和果色。对底物的特异性和表达水平不同，使植物呈现出各异的花色和果色。不同来源的不同来源的DFR DFR 对对3 3 种底物的亲和性有差别种底物的亲和性有差别，如

11、矮牵牛，如矮牵牛DFR DFR 主要催化主要催化DHMDHM，其次是其次是DHQDHQ，而对，而对DHK DHK 则无作用。在矮牵牛和兰花则无作用。在矮牵牛和兰花( Cymbidium hybrida) ( Cymbidium hybrida) 中，中，DFR DFR 能有效催化能有效催化DHQ DHQ 和和DHM DHM 并在花瓣中积累矢车菊素和飞燕草素，但是不能并在花瓣中积累矢车菊素和飞燕草素，但是不能有效地还原有效地还原DHK DHK 。在非洲菊。在非洲菊( Gerbera hybrida) ( Gerbera hybrida) 中，中，DFR DFR 能利用全部能利用全部3 3种二种二

12、氢黄酮醇作为催化底物，是橙色的天竺葵素存在于非洲菊但不存在于矮牵牛氢黄酮醇作为催化底物，是橙色的天竺葵素存在于非洲菊但不存在于矮牵牛中的原因。中的原因。通过矮牵牛、玉米和金鱼草等植物通过矮牵牛、玉米和金鱼草等植物DFR DFR 基因序列的比对基因序列的比对，发现发现DFR DFR 的底物结合特性是由一段保守序列决定的，其中的底物结合特性是由一段保守序列决定的，其中134 134 位氨基酸是控制位氨基酸是控制DFRDFR底物结合特性最为保守的氨基酸残基底物结合特性最为保守的氨基酸残基; Johnson ; Johnson 等也鉴定了等也鉴定了DFR DFR 与底物与底物专一性结合有关的区域，并通

13、过改变该区域的一个氨基酸使专一性结合有关的区域，并通过改变该区域的一个氨基酸使DFR DFR 优先催化优先催化DHKDHK。由此可见，由此可见，DFR DFR 的底物催化选择性是决定花色的主要原因。的底物催化选择性是决定花色的主要原因。5 DFR 5 DFR 基因底物特异性的分子基础基因底物特异性的分子基础 不同物种的不同物种的DFRDFR与底物的结合区域是高度保守的，与底物的结合区域是高度保守的，DFR DFR 的氨基酸序列的氨基酸序列决定其底物的种类。研究发现，决定其底物的种类。研究发现，其第其第134 134 位的氨基酸残基直接决定底物位的氨基酸残基直接决定底物的特异性的特异性。根据。根

14、据DFR DFR 的第的第134 134 位氨基酸残基的种类可分为位氨基酸残基的种类可分为3 3 种种: :其其134 134 位上有一个天冬酰胺残基位上有一个天冬酰胺残基( Asn) ( Asn) ，因此被称为，因此被称为Asn Asn 型型DFRDFR。其。其134 134 位位上有一个天冬氨酸残基上有一个天冬氨酸残基( Asp) ( Asp) ，不能有效地把，不能有效地把DHK DHK 还原为无色花葵素，还原为无色花葵素，这一类这一类DFRDFR被称为被称为Asp Asp 型型DFRDFR。矮牵牛和兰花。矮牵牛和兰花( Bromheadia ( Bromheadia finlaysoni

15、ana)finlaysoniana)的的DFR DFR 属于这类属于这类; ;其第其第134 134 位氨基酸残基既不是天冬位氨基酸残基既不是天冬酰胺也不是天冬氨酸，因此被称为酰胺也不是天冬氨酸，因此被称为非非Asn /Asp Asn /Asp 型型DFRDFR。植物中植物中Asn Asn 型型DFR DFR 分布广泛，单子叶植物中都是分布广泛，单子叶植物中都是Asn Asn 型型DFRDFR，Asp Asp 型型DFR DFR 只分布在部只分布在部分双子叶植物中分双子叶植物中。此外。此外 , ,只有少数植物含有非只有少数植物含有非 Asn Asn Asp Asp 型型 DFR. DFR. 有

16、有些同种植物中的不同些同种植物中的不同 DFR DFR 也分成不同的组也分成不同的组 , ,如豆科植物百脉根的如豆科植物百脉根的DFR1DFR1属于非属于非 Asn Asn Asp Asp 型型; DFR2 ; DFR2 和和 DFR3 DFR3 则属于则属于Asp Asp 型型; ;而而 DFR4 DFR4 和和 DFR5 DFR5 属于属于AsnAsn型型; ;苜蓿的苜蓿的 DFR1 DFR1 属于属于Asn Asn 型型, ,而而 DFR2 DFR2则属于则属于 Asp Asp 型等型等 在比较在比较几种重要植物的几种重要植物的 DFR DFR 时发现时发现 植物界中的大多数植物界中的大

17、多数 DFR DFR 都是都是 Asn Asn 型型Asp Asp 型和非型和非 Asn Asn Asp Asp 型型 DFR DFR 数量有限数量有限 并且在进化上分布较远由此推测并且在进化上分布较远由此推测 Asp Asp 型和非型和非 Asn Asn Asp Asp 型型 DFR DFR 有可能是由有可能是由 Asn Asn 型进化来的。型进化来的。6 DFR 6 DFR 基因的时空表达特性基因的时空表达特性不同物种的不同物种的DFR DFR 基因在不同发育期与不同部位的时空表达特性也有所基因在不同发育期与不同部位的时空表达特性也有所不同不同。亚洲百合的。亚洲百合的2 2 个植株中粉红色

18、被片带有斑点的个植株中粉红色被片带有斑点的“Montreux”DFR “Montreux”DFR 基因在着色的被片花药、花丝、雌蕊和红色的鳞片中大量表达，其表基因在着色的被片花药、花丝、雌蕊和红色的鳞片中大量表达，其表达量随着花的生长发育而增加开花期间达到最高。而黄色被片无斑达量随着花的生长发育而增加开花期间达到最高。而黄色被片无斑“ConnecticutKing”“ConnecticutKing”的的DFR DFR 基因仅在着色的花药与红色的鳞片中表达，基因仅在着色的花药与红色的鳞片中表达，在在2 2 个植株的未着色的叶子、茎与白色的鳞片中都没有检测到个植株的未着色的叶子、茎与白色的鳞片中都

19、没有检测到DFDF基因基因的表达。可见，的表达。可见，DFRDFR基因仅在花色素苷着色的器官中表达，并且此种基基因仅在花色素苷着色的器官中表达，并且此种基因的表达与花色素苷的产生相协调。百脉根因的表达与花色素苷的产生相协调。百脉根( Lotus japonicus) ( Lotus japonicus) 的基的基因组中存在着因组中存在着5 5 个个DFR DFR 因，能产生因，能产生6 6 个具有功能的个具有功能的mRNAmRNA，具有不同的，具有不同的组织特异性。组织特异性。Shimada Shimada 等检测了百脉根的果实等检测了百脉根的果实( ( 种子和豆荚种子和豆荚) ) 、花、花、

20、茎、叶、根和根瘤中的茎、叶、根和根瘤中的DFR DFR 基因的表达效果，发现基因的表达效果，发现DFR1 DFR1 存在于所有器存在于所有器官里，官里，DFR2 DFR2 主要积累在除了叶的其他器官中，而主要积累在除了叶的其他器官中，而DFR3 DFR3 只在茎和叶中只在茎和叶中特异表达，特异表达，DFR4 DFR4 和和DFR5 DFR5 除了根中微量表达外主要在地上部分。除了根中微量表达外主要在地上部分。这些这些研究结果表明研究结果表明DFR DFR 基因表达主要伴随着花瓣组织着色的进行，它的时基因表达主要伴随着花瓣组织着色的进行，它的时空表达特性与种属特异性有关。研究显示，不同物种的空表

21、达特性与种属特异性有关。研究显示，不同物种的DFR DFR 基因表达基因表达特性研究对该基因的转基因遗传操作具有重要意义。特性研究对该基因的转基因遗传操作具有重要意义。7 DFR 7 DFR 结构基因的启动子结构基因的启动子 植物基因启动子是重要的顺式作用元件植物基因启动子是重要的顺式作用元件 ，位于结构基因，位于结构基因 5 5端上游端上游区，指导全酶与模板的正确结合。活化区，指导全酶与模板的正确结合。活化 RNA RNA 聚合酶，决定转录的方向聚合酶，决定转录的方向和效率，直接影响基因的表达。和效率，直接影响基因的表达。 六倍体小麦有六倍体小麦有 3 3 种种 DFR DFR 基因基因 T

22、aDFRTaDFRA TaDFRA TaDFRB TaDFRB TaDFRC C 分别分别位于染色体位于染色体 3A3A，3B 3B 和和 3D3D上，都有上，都有 3 3 个内含子。在个内含子。在 3 3 种种DFR DFR 基因启基因启动子序列中存在动子序列中存在 Myb Myb 类转录因子类转录因子P P的结合位点，它和的结合位点，它和 G Gbox box 的核心元的核心元件共同调控件共同调控 DFR DFR 基因的表达，这一结构可能调控小麦基因的表达，这一结构可能调控小麦 DFR DFR 基因的组织基因的组织特异性表达，在特异性表达，在 TaDFRTaDFRB B 中有中有 3 3

23、个这种元件。而个这种元件。而 TaDFRTaDFRA A 和和TaDFRTaDFRC C 只有只有2 2个，因此个，因此 TaDFRTaDFRB B 的表达量要比其他的表达量要比其他2 2种种 DFR DFR 基因在小麦基因在小麦的子叶的子叶 根和种皮等器官中的表达量高。根和种皮等器官中的表达量高。 葡萄葡萄 DFR DFR 基因的启动子含有基因的启动子含有 G Gbox box 类元件类元件 bZIP bZIP 和和 Myb Myb 类转录类转录因子的结合位点，同时葡萄的启动子和因子的结合位点，同时葡萄的启动子和 uidA uidA 葡糖苷酶融合构成融合葡糖苷酶融合构成融合体，共同调节体，共

24、同调节 DFR DFR 基因的表达基因的表达 3 3 种调控因子共同作用使葡萄种调控因子共同作用使葡萄 DFR DFR 基基因在根，茎和叶等几乎所用组织中都有表达。因在根，茎和叶等几乎所用组织中都有表达。 将葡萄将葡萄 DFR DFR 基因的启动子与基因的启动子与 GUS GUS 基因融合后转化红色苹果细基因融合后转化红色苹果细胞悬浮体系，能够检测到胞悬浮体系，能够检测到 GUS GUS 和和 uidA uidA 基因的表达，同时基因的表达，同时 DFR DFR 基基因的表达量增加。因的表达量增加。8 DFR 8 DFR 基因的转录调控基因的转录调控 迄今发现的花青素合成调节因子主要包括迄今发

25、现的花青素合成调节因子主要包括 Myb Myb 转录因子，转录因子，Myc Myc 家族的家族的 bHLH bHLH 转录因子和转录因子和 WD40 WD40 蛋白。其中蛋白。其中 Myb Myb 转录因子含有保转录因子含有保守的守的 DNA DNA 结合结构域，结合结构域， 每个每个 Myb Myb 结构域约含结构域约含 515152 52 个氨基酸个氨基酸残基，包含一系列高度保守的残基和间隔序列，并含有特异的残基，包含一系列高度保守的残基和间隔序列，并含有特异的 DNA DNA 序列识别区和启动子结合区。如玉米的序列识别区和启动子结合区。如玉米的 C1 P1 C1 P1 和和 P P基因；基因；bHLH bHLH 家族蛋白都有一个螺旋环螺旋结构区域和家族蛋白都有一个螺旋环螺旋结构区域和 4 4 个保守功个保守功能区域能区域 bHLH bHLH 转录因子可以结合到特异的转录因子可以结合到特异的 DNA DNA 序列上。某些序列上。某些 bHLH bHLH 转录因子在花青素途径调控中需要与转录因子在花青素途径调控中需要与 Myb Myb 类转录因子共同类转录因子共同作用，如金鱼草作用，如金鱼草 Delila Delila 基因。基因。WD40 WD40 重复