检测技术及梅毒实验室检测技术

1、艾滋病检测技术广州医科大学附属第五医院检验科詹铀超窗口期窗口期HIVHIV感染后的血清学动态感染后的血清学动态Anti-P24HIV RNA感染感染 1周周 2周周 3周周 4周周1年年 2年年 3年年.1 0年年.急性期急性期潜伏期潜伏期Anti-gp41/120(anti-gp36)Ag艾滋病期艾滋病期Ab浓浓度度试验室假阴性报告的原因分析窗口期窗口期非典型血清学转换非典型血清学转换病毒变异病毒变异实验室误差实验室误差实验室进行艾滋病抗体筛查很很多的原因可能造成漏检, 曾经有文献具体分析过造成漏检的原因, 主要原因有因为窗口期的原因造成漏检, 因为病毒变异以及实验室误差等原因造成的漏检.

2、其中最主要的原因是因为窗口期的问题造成的漏检. 占整体比例的93.7%. 筛筛 查查 试试 验验复复 核核 检检 测测确确 证证 试试 验验检测程序及流程图检测程序及流程图 HIV抗体筛查检测流程抗体筛查检测流程样品样品初筛试验初筛试验筛查试剂筛查试剂阳性反应阳性反应阴性反应阴性反应复检试验复检试验原有试剂原有试剂 + +另一不同原理另一不同原理（或厂家或厂家 ）试剂或另外两种试剂或另外两种不同原理不同原理 （或厂家或厂家 ）试剂试剂均阳性反应均阳性反应一阴一阳一阴一阳均阴性反应均阴性反应确证试验确证试验报告阴性报告阴性酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光法化学发光法快速检

3、测及其它检测快速检测及其它检测 明胶颗粒凝集试验（明胶颗粒凝集试验（PA） 免疫渗滤试验：斑点免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验验电化学发光试验电化学发光试验其它快速筛查试验方法其它快速筛查试验方法艾滋病唾液尿液检测试剂艾滋病唾液尿液检测试剂初筛检测方法初筛检测方法酶联免疫试验酶联免疫试验 ( ELISA ) p（1）胶体金（胶体硒）法）胶体金（胶体硒）法p（2）明胶凝集法）明胶凝集法p（3）斑点印迹试验）斑点印迹试验p（4）电化学发光法）电化学发光法快速检测方法快速检测方法（1）胶体金法）胶体金法p原理：采用双抗原夹心法免疫测定

4、原理，使用纯化原理：采用双抗原夹心法免疫测定原理，使用纯化HIV-1/2HIV-1/2基因重组抗原，分别固定于硝酸纤基因重组抗原，分别固定于硝酸纤维膜上，作为检测线，并且用这些抗原标记胶体金。当待检样本中存在维膜上，作为检测线，并且用这些抗原标记胶体金。当待检样本中存在HIVHIV抗体时，先和金标抗体时，先和金标记抗原结合，由于层析作用向前移动，当遇到膜上固定的抗原时，形成记抗原结合，由于层析作用向前移动，当遇到膜上固定的抗原时，形成Ag-Ag-AbAb-Ag-AU-Ag-AU复合物而复合物而富集在包被线上，形成一条或二条红色线，是阳性结果。反之，若标本中不存在富集在包被线上，形成一条或二条红

5、色线，是阳性结果。反之，若标本中不存在HIVHIV抗体，则抗体，则不会出现红线，是阴性结果。无论样本中是否含有不会出现红线，是阴性结果。无论样本中是否含有HIVHIV抗体，在质控线区域都会形成另一条红抗体，在质控线区域都会形成另一条红色线。色线。 T-检测线检测线C-质控线质控线1.准备试剂与相关耗材2.每个样本检测每个样本检测用一片试剂，标用一片试剂，标上相应样本编号上相应样本编号. 3. 加入50 l 全全血或血清和血浆血或血清和血浆4. 5-20分钟读取分钟读取结果结果 5.读取和记录检读取和记录检测结果测结果. 阳性反应阳性反应：在质在质控窗和反应窗控窗和反应窗均均显示红线。显示红线。

6、阴性反应阴性反应：只在：只在质控窗出现红线，质控窗出现红线，反应窗没有红线。反应窗没有红线。无效无效：在质控窗：在质控窗没有出现红线，没有出现红线，说明检测无效，说明检测无效，需要重新检测。需要重新检测。第四代试剂联合检测HIV P24抗原和抗HIV 抗体电化学发光法第一代艾滋病抗体检测试剂检测的是HIV-1 的IgG抗体, 检测的窗口期大约是42天. 第二代试剂可以检测HIV-1和HIV-2型的IgG抗体窗口期缩短至35天. 第三代的试剂可以同时检测IgG和IgM抗体, 将检测的窗口期又缩短至22天. 第四代的可以联合检测HIV的P24抗原和HIV-1/2型抗体的试剂, 大约平均比较第三代试

7、剂缩短6天时间. Elecsys HIV Combi 的检测原理罗氏第四代HIV Combi试剂检测的是HIV P24抗原和HIV-1/HIV-2抗体.检测P24抗原使用的是单克隆的HIV 抗体. 检测HIV-1/2抗体使用的是大量的重组抗原,来捕捉IGg和IGM 抗体. 钌钌生物素生物素辣根过氧化物酶标记的磁性珠辣根过氧化物酶标记的磁性珠 电化学发光电化学发光快速检测法的优先使用快速检测法的优先使用 技术角度需要考虑：技术角度需要考虑：需要快速得到结果、免去试剂和样本的冷链运输环节、需要快速得到结果、免去试剂和样本的冷链运输环节、小空间实验室的成本效益、检测的简单性等。小空间实验室的成本效益

8、、检测的简单性等。 优先使用包括：优先使用包括：应急、门诊急诊，如应急、门诊急诊，如VCT、母婴传播、临床评估、农、母婴传播、临床评估、农村血检、术前检测、紧急事件等。村血检、术前检测、紧急事件等。HIVHIV快速检测的局限性快速检测的局限性 一般不用于血液筛查一般不用于血液筛查 有一定的假阳性反应有一定的假阳性反应 窗口期问题：有一定的假阴性反应（尤其暴露时间窗口期问题：有一定的假阴性反应（尤其暴露时间33个月）个月）HIVHIV抗体快速检测具有快速优势，但是抗体快速检测具有快速优势，但是“快速快速”并不意味着对早期感染者的快速诊断，因为并不意味着对早期感染者的快速诊断，因为HIVHIV感染

9、后产生抗体应答需要一段时间，存在窗口期感染后产生抗体应答需要一段时间，存在窗口期（即从暴露至最早检测出的时间），即使采用分子（即从暴露至最早检测出的时间），即使采用分子生物学试验，也有生物学试验，也有1 12 2周的窗口期。周的窗口期。筛查检测结果的报告和处理筛查检测结果的报告和处理抗体筛查试验的局限性抗体筛查试验的局限性艾滋病实验室生物安全n生物安全细则n职业暴露的防范梅毒实验室检测技术广州医科大学附属第五医院检验科詹铀超主要内容n实验室检测注意事项及临床意义n梅毒实验室检测策略探讨常用梅毒实验室检测方法常用梅毒实验室检测方法n病原学检测n血清学检测病原学检查病原学检查n原理： 一期、二期梅

10、毒时 ，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。n方法：（1）暗视显微镜检查n （ 2）镀银染色法n （ 3）核酸检测（血液标本？）n注：梅毒螺旋体目前体外人工培养还没有获得成功，n仅能通过接种兔睾丸等部位进行有限增殖。梅毒血清学检测方法梅毒血清学检测方法n1) 非梅毒螺旋体抗原血清学试验 （非特异性梅毒抗体）n(2) 梅毒螺旋体抗原血清学试验 （特异性梅毒抗体）两类方法。非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理n梅毒螺旋体一旦感染人

11、体，宿主可对螺旋体表面的脂质作出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体）。n未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴性。非梅毒螺旋体抗原血清学原理非梅毒螺旋体抗原血清学原理n方法包括：（1）快速血浆反应素环状卡片试验 (RPR)（2）甲苯胺红不加热血清试验（ TRUST ）（3）性病研究实验室试验 (VDRL) 等。n基本成分是心磷脂 卵磷脂和胆固醇n抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见n上述方法的敏感性和特异性都基本相似非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图非梅毒螺旋体抗原血清

12、学试验操作要点非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点1 、仪器：水平旋转仪，转速100r/min，转幅约18mm2、定性试验n加样：吸取0.05mL血清( 浆) 放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内n加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1 滴抗原（ 60滴/mL，1滴=17ul ）n反应：水平旋转仪旋转8分钟(23 - 29 ）亮光下观察结果。非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点3、定量试验n稀释夜准备：在反应纸板圈内 加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开n加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。n下同定性实验。1:11

13、:11:21:21:81:8非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义n早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后 一期梅毒 1 年后转为阴性 二期梅毒 2 年后转为阴性。 晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50% 病人血清反应仍为阳性。n非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。n因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点假阳性反应n技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可排除。n生物学假阳性反应 (

14、 一般滴度小1:8），应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验 如TPPA等进行排除。梅毒螺旋体抗原血清学试验原理梅毒螺旋体抗原血清学试验原理n抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重组特异抗原），检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。n感染梅毒螺旋体后 ，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。梅毒螺旋体抗原血清学试验方法梅毒螺旋体抗原血清学试验方法n梅毒螺旋体颗粒凝集试验 (TPPA)n梅毒螺旋体血球凝集试验 (TPHA)n梅毒酶联免疫吸附试验（ ELISA）n化学发光免疫分析法（CLIA）n梅毒免疫层析法- 梅毒快速检测 (RT)n荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS ）n梅毒螺旋体蛋白印迹试验（ WB ）TPPAnTPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高的敏感性和特异性。nTPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验