定量PCR方法总结

1、实时荧光定量实时荧光定量PCR方法总结方法总结 (Real time Quantitative PCR)内容内容实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理实时荧光定量实时荧光定量PCR大致步骤大致步骤注意事项注意事项实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 实时荧光定量实时荧光定量PCR是在是在PCR反应体系中加入荧光基团，反应体系中加入荧光基团，荧光基团可与双链荧光基团可与双链DNA结合发出荧光而在游离时不发光，结合发出荧光而在游离时不发光，随着随着DNA扩增荧光信号逐渐增强，通过测定荧光信号强度扩增荧光信号逐渐增强，通过测定荧光信号强度实时监测整个实时监测整个PCR进程。进程。 SYBR Gre

2、en 荧光扩增曲线可以分成四个阶段：基线期、指数增长期、荧光扩增曲线可以分成四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。只有在指数增长期，线性增长期和平台期。只有在指数增长期，PCR产物量的产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以选择在这个对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以选择在这个阶段进行定量分析。阶段进行定量分析。 基线期基线期指数增长期指数增长期线性增长期线性增长期平台期平台期一些术语一些术语术语术语作用作用基线基线PCR的最初几次循环，在基线范围内荧光信号几乎没有变化，即扩增曲的最初几次循环，在基线范围内荧光信号几乎没有变化，即扩增曲线的水平部分，默认值为线的水平部

3、分，默认值为3-15个循环个循环阈值阈值人为设定的一个值，一般是人为设定的一个值，一般是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。倍。阈值线与扩增曲线的交点就是阈值线与扩增曲线的交点就是CT值值CT值值从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数阳性对照阳性对照监控系统故障监控系统故障阴性对照阴性对照NTC监控污染监控污染管家管家(内参内参)基因基因校准细胞数量、抽提效率、纯化损失、反转录效率等生物学误差，常用校准细胞数量、抽提效率、纯化损失、反转录效率等生物学误差，常用的有的有-actin、GAPDH参比荧光参比荧光(ROX)校准

4、移液枪、校准移液枪、PCR管质量和仪器等物理误差管质量和仪器等物理误差熔解曲线熔解曲线鉴定鉴定PCR有无杂带、引物二聚体有无杂带、引物二聚体实时荧光定量实时荧光定量PCR大致步骤大致步骤实时定量实时定量PCR提取总提取总RNA反转录反转录电泳检测电泳检测（可省）（可省）PCRPCR后电泳检测引物后电泳检测引物可行性、产物大小可行性、产物大小割胶纯化，获得标准割胶纯化，获得标准品，然后梯度稀释品，然后梯度稀释标准曲线标准曲线提取提取RNA： 用剪刀剪下用剪刀剪下50-100mg组织放入组织放入2ml离心管中，加入离心管中，加入1ml Trizol匀浆，一般匀浆，一般5-10s即可（即可（匀浆机使

5、用前须用匀浆机使用前须用0.1% DEPC溶液浸泡，检查刀口是否有残留组织溶液浸泡，检查刀口是否有残留组织）。然后加入）。然后加入氯仿离心，取上清（氯仿离心，取上清（勿吸入白色沉淀勿吸入白色沉淀）加入异丙醇离心，）加入异丙醇离心，弃上清用弃上清用75%乙醇洗涤沉淀，晾干后加入乙醇洗涤沉淀，晾干后加入DEPC水（由水（由0.1%DEPC溶液经高压制得）溶解，然后溶液经高压制得）溶解，然后尽快尽快反转录，如反转录，如要长期保存则放入液氮或超低温冰箱。要长期保存则放入液氮或超低温冰箱。 离心管不能用记号笔标号，可用铅笔。离心管不能用记号笔标号，可用铅笔。检测及稀释检测及稀释 用微量分光光度计测定用微

6、量分光光度计测定RNA溶液的纯度（溶液的纯度（OD260/OD280要要在在1.82.0之间）和浓度，然后将各样品之间）和浓度，然后将各样品RNA稀释至统一稀释至统一浓度（如浓度（如1g/L）。）。 如果要电泳检测如果要电泳检测RNA完整性，最好采用甲醛变性凝胶电泳。完整性，最好采用甲醛变性凝胶电泳。 反转录反转录 按试剂盒说明书，将除模板按试剂盒说明书，将除模板RNA外的所有试剂加在一个外的所有试剂加在一个1.5ml离心管中，然后混匀后分加到各离心管中，然后混匀后分加到各0.2 ml离心管中，离心管中，并且大约每并且大约每10个样需多制备一个样的混合液。最好采用个样需多制备一个样的混合液。最

7、好采用20L体系。之后定量的混合液也需按此操作。反转录获体系。之后定量的混合液也需按此操作。反转录获得得cDNA之后可分装后之后可分装后-20长期保存。长期保存。mRNAcDNA引物设计引物设计 登录登录，搜索目的基因，搜索目的基因mRNA序列（可能不止一个），然后用序列（可能不止一个），然后用primer premier 5.0软件设计引物，根据各项参数可对设计的引物进行适软件设计引物，根据各项参数可对设计的引物进行适当调整。大连宝生物公司（当调整。大连宝生物公司（Takara）免费提供引物设计服）免费提供引物设计服务，但不是绝对能设计出来

8、。务，但不是绝对能设计出来。 示例示例鸡胰蛋白酶鸡胰蛋白酶原原mRNAprimer premier 5.0软件设计引物流程软件设计引物流程将将mRNA序列粘贴到栏中，然后点击序列粘贴到栏中，然后点击Primer 打开软件，点击打开软件，点击FileNewDNA Sequence，弹出如下，弹出如下对话框。对话框。 点击点击Search，弹出右边对话框，可设置引物搜索条件，弹出右边对话框，可设置引物搜索条件，然后点击然后点击OK，又弹出一对话框，再点，又弹出一对话框，再点OK。 得到搜索结果，一般评分越高，左下无得到搜索结果，一般评分越高，左下无Found，引物对，引物对越好，然后根据各项参数决

9、定是否对引物对进行编辑调整。越好，然后根据各项参数决定是否对引物对进行编辑调整。PCR后电泳检测后电泳检测 可用普通可用普通PCR也可用实时荧光定量也可用实时荧光定量PCR（较贵）扩增（较贵）扩增cDNA，然后用，然后用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物。如要制作标琼脂糖凝胶电泳检测产物。如要制作标准品则将产物条带割下，然后用纯化试剂盒对凝胶进行纯准品则将产物条带割下，然后用纯化试剂盒对凝胶进行纯化。如不立即做则将凝胶于化。如不立即做则将凝胶于-20保存。保存。实时荧光定量实时荧光定量PCR 按试剂盒说明书操作。采用按试剂盒说明书操作。采用ABI 7300定量定量PCR仪，用八仪，用八联管跑定量较方便

10、，使用前注意检查管壁是否完好。联管跑定量较方便，使用前注意检查管壁是否完好。ABI 7300定量定量PCR仪操作程序仪操作程序 添加引物名称到右边方框中，如已有引物中没有所需引物添加引物名称到右边方框中，如已有引物中没有所需引物名称则新建一个。名称则新建一个。选择选择ROX 设置反应孔的名称、类型（标准品、样品、设置反应孔的名称、类型（标准品、样品、NTC）、编号）、编号以及标准品的浓度以及标准品的浓度 。 设置反应程序、反应体积，点击添加溶解曲线，然后设置反应程序、反应体积，点击添加溶解曲线，然后File保存在文件夹中，最后点击保存在文件夹中，最后点击Start。 如果要去掉某个步骤则双击它

11、，点击如果要去掉某个步骤则双击它，点击Delete。查看结果查看结果 较好的线性图谱呈较好的线性图谱呈S形，下面的对数图谱曲线断开是由于形，下面的对数图谱曲线断开是由于基线设置的基线设置的3-15，所以从接近，所以从接近15处断开。处断开。对数图谱对数图谱线性图谱线性图谱 标准曲线斜率应在标准曲线斜率应在-3.9-2.9间，尽量接近间，尽量接近-3.32，R20.98，尽量接近尽量接近1。 溶解曲线应只有一个单峰。如果出现两个以上的峰说明有溶解曲线应只有一个单峰。如果出现两个以上的峰说明有非特异性产物或引物二聚体产生，需要调整反应程序或更非特异性产物或引物二聚体产生，需要调整反应程序或更换引物

12、。换引物。 样品样品CT值一般控制在值一般控制在1535之间。如果之间。如果CT值太大则说明模板值太大则说明模板浓度太低，需加大模板量；如果浓度太低，需加大模板量；如果CT值太小则可稀释模板。值太小则可稀释模板。 原则上每个样品需要做原则上每个样品需要做2-3个平行孔，平行孔间个平行孔，平行孔间CT值差值不值差值不能大于能大于1。 定量方法定量方法 分为绝对定量和相对定量。绝对定量测定模板的分为绝对定量和相对定量。绝对定量测定模板的精确拷贝精确拷贝数数，通常需要用一系列已知拷贝数的标准品制作标准曲线，通常需要用一系列已知拷贝数的标准品制作标准曲线，标准品主要是纯化的质粒标准品主要是纯化的质粒D

13、NA，制备复杂；而相对定量只，制备复杂；而相对定量只测定模板的测定模板的相对量相对量而不测定其具体拷贝数，比较不同样本而不测定其具体拷贝数，比较不同样本间的倍数关系。间的倍数关系。 相对定量测定方法包括两种：双标准曲线法和比较相对定量测定方法包括两种：双标准曲线法和比较CT法法（2-CT）。其中双标准曲线法类似于绝对定量，只是所）。其中双标准曲线法类似于绝对定量，只是所用的标准品可用用的标准品可用cDNA或或PCR产物等，不需要知道其具体产物等，不需要知道其具体拷贝数，只要知道其稀释梯度即可。拷贝数，只要知道其稀释梯度即可。两种相对定量方法的比较两种相对定量方法的比较双标准曲线法双标准曲线法比

14、较比较C CT T法（法（ 2-CT ）对扩增效率要求不高对扩增效率要求不高要求目标基因和内参基因的扩要求目标基因和内参基因的扩增效率基本一致且接近增效率基本一致且接近100%100%每次反应都要作标准曲线每次反应都要作标准曲线不需要做标准曲线不需要做标准曲线结果较精确结果较精确结果有一定误差结果有一定误差注意事项注意事项试验前详细了解试验步骤，试验材料准备齐全并适当处试验前详细了解试验步骤，试验材料准备齐全并适当处理，如理，如DEPC浸泡、高压、干烤、酒精棉球擦拭等。浸泡、高压、干烤、酒精棉球擦拭等。试验过程中一定要试验过程中一定要戴手套戴手套，最好戴，最好戴2层，并注意更换。层，并注意更换

15、。大部分试剂都是有毒物质，如焦炭酸二乙酯大部分试剂都是有毒物质，如焦炭酸二乙酯DEPC、溴、溴化乙锭化乙锭EB可能具有致癌作用。可能具有致癌作用。大部分步骤需要在冰上操作。大部分步骤需要在冰上操作。分装样品和引物，避免反复冻融。分装样品和引物，避免反复冻融。加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度加入试剂之前，把它混匀一下，以免放置时间长了浓度不均。不均。加好各反应液后加好各反应液后“离心、振荡、离心离心、振荡、离心”再分装到各管或再分装到各管或上机。上机。定量时八联管管盖和管壁尽量不用手碰，定量时八联管管盖和管壁尽量不用手碰，不能不能用记号笔用记号笔标号，可按顺序加样并在标号，可按顺序加样并在管盖边缘标记正反管盖边缘标记正反，因为机器，因为机器是透过管盖测定管底