细胞工程的理论基础

1、第二章第二章 细胞工程的理论基础细胞工程的理论基础山东师范大学生命科学学院山东师范大学生命科学学院是指从活的机体中取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。n组织培养的概念组织培养的概念 组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。A：细胞培养：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。B：组织培养：组织培养：将活体的一小片组织放

2、在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。 从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。C：器官培养：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。体外培养的种类体外培养的种类二、二、 细胞培养的现实意义细胞培养的现实意义三、细胞培养的优点三、细胞培养的优点1.1.研究的对象是活细胞研究的对象是活细胞 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可力，并可长时间监控长

3、时间监控、检测甚至定量评估一部分、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的情况，包括活细胞活细胞的形态、结构、生命的形态、结构、生命活动等。活动等。2.2. 研究条件可以人为控制研究条件可以人为控制 可以根据需要，控制包括可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。3. 研究的样本可以达到比较均一性研究的样本可以达到比较均一性 通

4、过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。四、细胞培养的缺点四、细胞培养的缺点 因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能功能又具有某些改变的特定的细胞群体又具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将，而不能将之与体内的细胞完全等同。之与体内的细胞完全等同。五、细胞培养的工作原则五

5、、细胞培养的工作原则u有标准化的工作方法有标准化的工作方法 u培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKSHANKS液及液及 抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。称、浓度、消毒与否和制备日期等。 u一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已中尤其重要的是：培

6、养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。消毒品与未消毒品应分别存放。 第二节第二节 组织培养的细胞生物学组织培养的细胞生物学一、体内外细胞的差异和分化一、体内外细胞的差异和分化（一）体内外细胞的差异（一）体内外细胞的差异 培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似态，分化减弱或不显，出现类似“反祖反祖” ” 现象；表现为细现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。（二）培养细胞的分化（二）培养细胞的分化 1不适应(

7、Deadaption)： 表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性的丧失.2脱分化或去分化(Dedifferentiation) 细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。二、培养细胞形态分类二、培养细胞形态分类体外培养细胞类型（体外培养细胞类型（1）上皮细胞型上皮细胞型体外培养细胞类型（体外培养细胞类型（2）成纤维细胞型成纤维细胞型三、培养细胞的生长特点三、培养细胞的生长特点（一）贴附（二）接触抑制（三）密度抑制四、培养细胞的生长和增殖过程四、培养细胞的生长和增殖过程（一）组织培养细胞生命

8、期一）组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells)所谓培养细胞生命期培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。正常培养的细胞周期原代培养原代培养(Primary Culture)期期也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。特点特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与 体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。传代期传代期特点特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型。传代传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其

9、它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。衰退期衰退期特点特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖， 最后衰退凋亡。（二）体外培养细胞一代生存期（二）体外培养细胞一代生存期潜伏期指数增生期停滞期所谓细胞的所谓细胞的“一代一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。（三）单个细胞的生长过程（三）单个细胞的生长过程五、体外培养细胞的遗传学特征五、体外培养细胞的遗传学特征（一）核型变化（二）永生化和恶变（三

10、）细胞性别六、体外培养细胞的生存环境六、体外培养细胞的生存环境（一）无污染环境（二）温度（三）气体环境和氢离子浓度七、体外培养细胞生存所需基本物质七、体外培养细胞生存所需基本物质（一）糖（二）氨基酸（三）维生素（四）促生长因子（五）其它物质第三节第三节 建立细胞系或细胞株建立细胞系或细胞株一、体外培养细胞的种类和命名一、体外培养细胞的种类和命名（一）初代培养（一）初代培养初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养(5ubculture)的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。（二）细胞系（二）细胞系初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，

11、即称之为细胞系。有限细胞系无限细胞系 (三三)克隆细胞株克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选购方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。 (四四)二倍体细胞二倍体细胞培养细胞染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同(2n细胞占75或80以上)的细胞群，称二倍体细胞培养。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。(五五)肿瘤细胞系或株肿瘤细胞系或株 是现有细胞系中最多的一类，我国已建立细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈上皮细胞型，常已传几十代或百代以上，并并具有不死性和异体接种致瘤性。 对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名

12、称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，今列举以下几种代表性的细胞名称供参考； HeLa：为供体患者的性名(来源于宫颈癌) CHO：中国地鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary) 宫743：富颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3；美国国立卫生研究所(National Institute of Health)建立, 每3天传代一次，每次接种3106细胞毫升。（六）细胞系或细胞株的命名（六）细胞系或细胞株的命名二、建立细胞系（或株）的要求二、建立细胞系（或株）的要求（一）组织来源（二）细胞生物学检测（三）培养条件和方法三、已建立细胞系或株的签定、管理和使用三、已建立细胞系或株的签定、管理和使用培培 养养 简简 历：历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、 供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等。冻冻 存存 液：液：培养基和防冻液名称。细细 胞胞 活活 力：力：融解前后细胞接种存活率和生长特性。培培 养养 液：液：培养基种类