蛋白质分析方法进展与应用

1、蛋白质分析方法进展与应用 第十一组内容内容 前言前言 分析法概述分析法概述 电泳技术电泳技术 质谱技术及应用质谱技术及应用前言前言 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催大分子，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。随着生命科学的发展，仪器分析手段研究对

2、象。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。一领域的研究发展迅速。 浊度法和凯氏定氮法浊度法和凯氏定氮法 吸光光度法吸光光度法 紫外光谱吸收法紫外光谱吸收法 双缩脲法双缩脲法 劳里法劳里法 4-4-喹啉甲酸法（喹啉甲酸法（BCABCA） 染料探针法染料探针法 染料染料- -金属配合物探针法金属配合物探针法 共振瑞利散射法共振瑞利散射法分析法概述分析法概述 蛋白质表面形成一个蛋白质表面形成一个有机染料的覆盖层，这种有机染料的覆盖层，这种以蛋白质为支撑核心的大以蛋白质为支撑核心的大的染料聚集体远大于染

3、料的染料聚集体远大于染料自身聚集体的体积，因此自身聚集体的体积，因此两者结合后，光散射的强两者结合后，光散射的强度急剧增加，并与加入的度急剧增加，并与加入的蛋白质浓度成正比。共振蛋白质浓度成正比。共振散射强度通常较单一的瑞散射强度通常较单一的瑞利散射提高几个数量级利散射提高几个数量级 荧光光度法荧光光度法 内源荧光法内源荧光法 外源荧光法外源荧光法 有机荧光探针有机荧光探针 稀土荧光探针稀土荧光探针 荧光偏振荧光偏振 时间分辨荧光光谱法时间分辨荧光光谱法 激光诱导时间分辨免疫分析法激光诱导时间分辨免疫分析法 高效液相色谱法高效液相色谱法 电泳法电泳法分析法概述分析法概述电泳技术电泳技术 等电聚

4、焦电泳等电聚焦电泳 固相固相pHpH梯度等电聚焦（梯度等电聚焦（ IPGIEFIPGIEF） 凝胶电泳凝胶电泳 SDSSDS尿素聚丙烯酰胺尿素聚丙烯酰胺 用于低离子强度用于低离子强度下不溶的膜蛋白下不溶的膜蛋白 非变性凝胶电泳非变性凝胶电泳可区分仅有一个电荷单可区分仅有一个电荷单位差别的分子，降低蛋位差别的分子，降低蛋白质变性机率，可直接测酶活白质变性机率，可直接测酶活 不连续盘状电泳不连续盘状电泳 固相固相pHpH梯度与载体两性电解质梯度与载体两性电解质pHpH梯度的区别在于前者的分子不是梯度的区别在于前者的分子不是两性分子，在凝胶聚合时便形成两性分子，在凝胶聚合时便形成pHpH梯度，不随环

5、境电场条件的改变而梯度，不随环境电场条件的改变而改变；后者是两性分子，在电场中改变；后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成迁移到自己的等电点后才形成pHpH梯梯度。它比传统的度。它比传统的IEFIEF具有更高的分具有更高的分辨率、更大的上样量。辨率、更大的上样量。 包含两种以上的缓冲溶液、包含两种以上的缓冲溶液、pHpH和凝胶孔径，多用于分析和凝胶孔径，多用于分析浓度较稀的样品，可使蛋白质浓缩数百倍。浓度较稀的样品，可使蛋白质浓缩数百倍。 浓缩效应浓缩效应 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应 不连续盘状电泳不连续盘状电泳质谱技术质谱技术 质谱（质谱（ M SM S）是带电原子、

6、分子或分子碎片）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比的大小顺序排列的图谱。按质荷比的大小顺序排列的图谱。以往质谱仅用于小分子挥发物质的分析，由以往质谱仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开析离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值（

7、M/ZM/Z值）的蛋白质离子分离开来，经过离子检值）的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的测器收集分离的离子，确定离子的M/ZM/Z值，分析值，分析鉴定未知蛋白质。鉴定未知蛋白质。蛋白质的质谱分析方式蛋白质的质谱分析方式 蛋白质图谱（蛋白质图谱（protein mappingprotein mapping）：即用特异性的酶解或）：即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获

8、取待测蛋白序列。将蛋白质之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制绘制“肽图肽图”是一重要测列方法。是一重要测列方法。 利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基。 用化学探针或酶解使蛋白或肽从端或端逐一降解下氨用化学探针或酶解使蛋白或肽从端或端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，即梯基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，即梯状测序（状测序（ladder sequencingladder seque

9、ncing），经质谱检测，由相邻峰），经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。的质量差知道相应氨基酸残基。 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：灵敏度高，需试样量少，能究具有如下优点：灵敏度高，需试样量少，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。目前质谱主操作性、快速性及很好的普适性。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽

10、或二硫键数目和位置。目前软电酸排序及多肽或二硫键数目和位置。目前软电离技术的发展与完善使极性肽分子的分析成为离技术的发展与完善使极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到可能，检测限下降到fmolfmol级别，可测定分子量级别，可测定分子量范围则高达范围则高达100000Da100000Da快原子轰击质谱测量法（快原子轰击质谱测量法（FABMSFABMS） 快原子轰击是用快速惰性原子射击存在于底快原子轰击是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种物中的样品，使样品离子溅出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分

11、析，特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究，能析，特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究，能提供有关离子的精确质量。提供有关离子的精确质量。FABMS-MSFABMS-MS串联技术串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离/ /飞行时间飞行时间质谱测量法（质谱测量法（MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS） 待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质（的化学基质（matrixmatrix）混合挥发，用激光作用于）混合挥发，用激光作用于样品混合物，使化学基质吸收

12、光子而被激活。此样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。形成的多肽离子直接进入飞行时合物变成气态。形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪。将探测器录得的多肽间质量分析仪。将探测器录得的多肽m/zm/z同数据同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的的m/zm/z进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白。进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白。此法称为多肽质量指纹分析。此法称为多肽质量指纹分析。 优点：敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，优点：敏感度高，同

13、许多蛋白分离方法相匹配，现有数据库中有充足的关于多肽现有数据库中有充足的关于多肽m/zm/z的数据，因此的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。电子喷雾电离质谱测量法（电子喷雾电离质谱测量法（ ESI-MSESI-MS）由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样品由针孔射出时，喷射在高压下经过一细针孔。当样品由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。杂质成分挥发后，碎裂的多肽离份等其他杂质成分。

14、杂质成分挥发后，碎裂的多肽离子进入连续质量分析仪，选取某一特定子进入连续质量分析仪，选取某一特定m/zm/z的多肽离的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后分析电离片段并汇集成离子谱或非电离片段。随后分析电离片段并汇集成离子谱（ion spectrumion spectrum），通过数据库检索，由这些离子谱），通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确

15、、可靠。可靠。表面增强激光解析离子化表面增强激光解析离子化- -飞行时间飞行时间质谱技术（质谱技术（SELDI- TOF MS SELDI- TOF MS ）SELDISELDI技术是在基质辅助的激光解析离子化技术是在基质辅助的激光解析离子化质谱技术的基础上建立起来的，并利用经过特殊质谱技术的基础上建立起来的，并利用经过特殊处理的固相支持物或芯片的基质表面，制成蛋白处理的固相支持物或芯片的基质表面，制成蛋白质芯片。主要特点为样品可直接在晶片上进行样质芯片。主要特点为样品可直接在晶片上进行样品前处理，先在晶片上设计不同特性的化合物，品前处理，先在晶片上设计不同特性的化合物，可与特定种类蛋白质结合

16、，去除非专一性结合蛋可与特定种类蛋白质结合，去除非专一性结合蛋白质，直接串联飞行时间白质，直接串联飞行时间- -质谱仪进行分析，其出质谱仪进行分析，其出现的图谱再现性非常高，非常适合不同来源的样现的图谱再现性非常高，非常适合不同来源的样品比较。品比较。表面增强激光解析离子化表面增强激光解析离子化- -飞行时间飞行时间质谱技术（质谱技术（SELDI- TOF MS SELDI- TOF MS ）优点：优点：样品需要量非常微量（样品需要量非常微量（mlml为单位）且不为单位）且不需经过前处理，可将病人血液、尿液、组织萃取物等需经过前处理，可将病人血液、尿液、组织萃取物等直接点在晶片上而不需破坏蛋白

17、质，分析出来的图谱直接点在晶片上而不需破坏蛋白质，分析出来的图谱与正常人图谱比较，可得到蛋白质表现图谱的差异，与正常人图谱比较，可得到蛋白质表现图谱的差异，即可用来当作疾病的生物标志，而应用于临床诊断上，即可用来当作疾病的生物标志，而应用于临床诊断上，有研究显示利用这种方法在卵巢癌的诊断上甚至可达有研究显示利用这种方法在卵巢癌的诊断上甚至可达100%100%准确度。目前科学家利用此技术观察癌症不同准确度。目前科学家利用此技术观察癌症不同时期的蛋白质表现变化，希望能找到精确的癌症初期时期的蛋白质表现变化，希望能找到精确的癌症初期的生物标记，如此便可早期治疗以提高存活率。的生物标记，如此便可早期治

18、疗以提高存活率。傅立叶变换傅立叶变换- -离子回旋共振离子回旋共振质谱法（质谱法（FTICR-MSFTICR-MS）离子在均匀磁场中作回旋运动时，回旋频率、离子在均匀磁场中作回旋运动时，回旋频率、半径、速度和能量是半径、速度和能量是m/zm/z及磁场强度的函数，当及磁场强度的函数，当对离子施加与其回旋频率相同的射频电场作用时，对离子施加与其回旋频率相同的射频电场作用时，离子将同相位加速至一较大的半径回旋离子将同相位加速至一较大的半径回旋, ,从而产生从而产生可被接受的类似电流的信号。所检测的信号经过可被接受的类似电流的信号。所检测的信号经过傅立叶变换转换为质谱图。傅立叶变换转换为质谱图。 优点

19、优点 高分辨率高分辨率 便于实现串极质谱分析，可完成多级串联质谱如便于实现串极质谱分析，可完成多级串联质谱如CIDCID的的操作技术操作技术 便于使用外电离源并与色谱仪器联用便于使用外电离源并与色谱仪器联用 应用应用 质量测定质量测定 氨基酸序列的测定氨基酸序列的测定 蛋白质分子中二硫键位置的确定蛋白质分子中二硫键位置的确定 分析蛋白质表达分析蛋白质表达 蛋白质翻译后修饰蛋白质翻译后修饰 蛋白质组学蛋白质组学 傅立叶变换傅立叶变换- -离子回旋共振离子回旋共振质谱法（质谱法（FTICR-MSFTICR-MS）蛋白质质谱分析的应用蛋白质质谱分析的应用 近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采近年

20、来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件的应用使得串联质高，大规模数据库和一些分析软件的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用2D2D电泳及技术对整个酵母细胞裂解产物进行分电泳及技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出析，已经鉴定出14841484种蛋白质，包括完整的膜蛋白种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组和低丰度的蛋白质；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分，并利用质谱

21、进行鉴定磷酸化蛋白研究工作及采成分，并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白（用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白（SDNPSDNP）的分子结构等。的分子结构等。 蛋白质质谱分析的应用蛋白质质谱分析的应用 印度，印度，N.V.S. RamakrishnaN.V.S. Ramakrishna等人于等人于20052005年应用液相年应用液相色谱质谱串联测定人类血浆中一种新型的抗癫痫的药物色谱质谱串联测定人类血浆中一种新型的抗癫痫的药物gabapentingabapentin的量，仪器检测极限和人类血浆中最低检测量的量，仪器检测极限和人类血浆中最低检测量分别是分别是1010和和40ng/mL40ng/mL