第三章细胞生物学研究方法

1、 显微镜之于生物学，犹如望远镜之于天文学，细显微镜之于生物学，犹如望远镜之于天文学，细胞生物学的变革无不和显微技术的改进息息相关。胞生物学的变革无不和显微技术的改进息息相关。 1590年年J. 和和Z. Janssen父子制作第一台复式显微父子制作第一台复式显微镜，放大倍数不超过镜，放大倍数不超过10倍。倍。 1932年德国学者年德国学者Max Knolls 和和Ernst Ruska发发明了第一台电子显微镜明了第一台电子显微镜1、普通复式光学显微镜技术、普通复式光学显微镜技术2、相差显微镜技术、相差显微镜技术3、荧光显微镜技术、荧光显微镜技术4、激光共焦点扫描显微镜技术、激光共焦点扫描显微镜

2、技术人眼人眼100um1cm1mm100um10um1um100nm10nm1nm0.1nm光学显微镜光学显微镜电子显微镜电子显微镜扫描扫描 隧道显微镜隧道显微镜细菌细菌病毒病毒核糖体核糖体球蛋白球蛋白原子原子植物、植物、动物细胞动物细胞可见范围可见范围1）光学显微镜的组成）光学显微镜的组成光学放大系统光学放大系统照明系统照明系统机械和支持系统机械和支持系统目镜目镜物镜物镜光源光源折光镜折光镜聚光镜聚光镜（滤光片）（滤光片）指区分开两个质点间的最小距离。指区分开两个质点间的最小距离。D =0.61 N.Sin /2 ：光源波长：光源波长 ：物镜镜口角物镜镜口角（最大值可达（最大值可达140度）

3、度）N：介质折射率介质折射率 （空气中为（空气中为1） N.Sin /2 也称也称数值孔径数值孔径(镜口率镜口率)分辨率与光源的分辨率与光源的波长、波长、物镜镜口角物镜镜口角和和介质折介质折射率射率有关。有关。成像原理成像原理 样品被放置在光的通路中，样样品被放置在光的通路中，样品会对品会对光波光波产生干扰，这种干扰现产生干扰，这种干扰现象通过透镜被肉眼观察到象通过透镜被肉眼观察到。为什么为什么 照明系统的照明系统的波长波长是显是显微成像的一个重要因素，微成像的一个重要因素，波长决定能被检测样品波长决定能被检测样品的最小极限。的最小极限。 最大分辨率最大分辨率以可见光作光源，其最大的分辨率为：

4、以可见光作光源，其最大的分辨率为： 最好的玻璃透镜的最好的玻璃透镜的镜口角镜口角是是140140， sin sin /2的最大值为的最大值为0.940.94, ,空气的折射率为空气的折射率为1 1, , 最短的最短的可见光（蓝色光）的波长为可见光（蓝色光）的波长为450450nmnmD D292nm292nm用用油油作为光折射的介质作为光折射的介质:D=0.2m (光学显微镜最大分辨率光学显微镜最大分辨率)用紫外光作光源可使用紫外光作光源可使D提高到约提高到约0.1m 。分辨极限与有效放大率分辨极限与有效放大率对可见光来说，能清楚地分辨出相邻两点之对可见光来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小

5、间隔是间的最小间隔是0.2m，这是，这是分辨极限。分辨极限。有效放大率有效放大率：光学显微镜的分辨率约为：光学显微镜的分辨率约为0.2m，人眼的分辨率为，人眼的分辨率为0.2mm，因此显，因此显微镜的最大有效倍数为微镜的最大有效倍数为1000X。固定固定：杀死细胞，稳定细胞的化学成分：杀死细胞，稳定细胞的化学成分 固定剂：甲醛、戊二醛固定剂：甲醛、戊二醛包埋包埋：为了便于切片，防止样品移位。：为了便于切片，防止样品移位。 石蜡或树脂石蜡或树脂染色染色：给细胞的不同组分带上可区别：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征的颜色特征切片：切片：110m光线通过细胞后的变化v发明：发明： 1934193

6、5 荷兰物理学家荷兰物理学家Zernike 设设计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。计和发明相差显微镜，并获得诺贝尔奖。优点：优点：样品不需染色，可以观察活细胞。样品不需染色，可以观察活细胞。原理原理：把透过标本的可见光的把透过标本的可见光的光程差光程差变成变成振振幅差幅差，表现为，表现为明与暗明与暗的对比，从而提高了各的对比，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。得更清晰。xy透明玻璃透明玻璃产生相位差产生相位差产生振幅差产生振幅差Z有明暗之分有明暗之分吸光物质吸光物质 聚光器或光源上增加一聚光器或光源上增加一环形环形光阑光阑，使透

7、过聚光器的光线，使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本形成空心光锥，焦聚到标本上；上； 物镜后装有一块物镜后装有一块“相差板相差板”，相差板上涂有特殊吸光物质；相差板上涂有特殊吸光物质； 偏斜和未偏斜的两组光线之偏斜和未偏斜的两组光线之间增添了新的光程差，从而间增添了新的光程差，从而对样品密度的不同造成的对样品密度的不同造成的相相位差位差起起“夸大夸大”作用；作用；吸光区吸光区半透明半透明圆环圆环不透明的涂不透明的涂漆部分漆部分透明的环透明的环状部分状部分特点：光源为特点：光源为短波光短波光；有两个特殊的滤光片有两个特殊的滤光片： 第一：激发滤片第一：激发滤片 第二：阻断滤片第二：阻断滤片

8、荧光显微镜荧光显微镜Fluorescence image, DNA in blue and Microtubules in green 用于观察能激发出荧光的结构。用于观察能激发出荧光的结构。 用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。荧光显微镜及其照片荧光显微镜及其照片 1）分为：）分为：免疫荧光技术免疫荧光技术荧光素直接标记技术荧光素直接标记技术2）原理）原理 ：（以免疫荧光技术为例以免疫荧光技术为例）特定抗原特定抗原（细胞）（细胞）抗体抗体抗体抗原抗体抗原复合物复合物进行定位进行定位测定测定荧光素荧光素激发光激发光不同的荧光素不同的荧光素的激发光波长的

9、激发光波长范围不同，所范围不同，所以同一样品可以同一样品可以同时用两种以同时用两种以上的荧光素以上的荧光素（如：紫外线）（如：紫外线）3）局限性：）局限性：固定剂常会破坏抗原性；固定剂常会破坏抗原性； 包埋剂常会产生自发荧光。包埋剂常会产生自发荧光。原理：原理： 是由一个激光扫描显微镜在物镜的成像面上加是由一个激光扫描显微镜在物镜的成像面上加一个针孔组成，只有被照亮点发出的光才能通一个针孔组成，只有被照亮点发出的光才能通过共焦孔，偏离这一点的无用的荧光就被排除过共焦孔，偏离这一点的无用的荧光就被排除在最终的图像之外；在最终的图像之外； 物镜和聚光镜物镜和聚光镜同时同时聚焦聚焦到同一个小点，即它

10、们到同一个小点，即它们互相共焦点，极大的增加了对比度；互相共焦点，极大的增加了对比度； 逐点、逐行、逐面快速扫描，形成立体图像，逐点、逐行、逐面快速扫描，形成立体图像，能显示细胞样品的立体结构；能显示细胞样品的立体结构； 效果：效果：使观察到的图像反差和分辨率提高使观察到的图像反差和分辨率提高 分辨率比普通荧光学显微镜提高分辨率比普通荧光学显微镜提高1.41.7倍。倍。激光共焦点扫描显微镜的原理图激光共焦点扫描显微镜的原理图共聚焦显微镜及其显微图像共聚焦显微镜及其显微图像免疫荧光显微镜技术（免疫荧光显微镜技术（A）和激光扫描共焦显微镜技术）和激光扫描共焦显微镜技术(B)的比较的比较 倒置显微镜

11、倒置显微镜 其结构组成与普通其结构组成与普通显微镜一样，所不同显微镜一样，所不同的是它的物镜与照明的是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来，系统的位置颠倒过来，物镜在载物台的下方，物镜在载物台的下方，可直接对培养的细胞可直接对培养的细胞进行照明和观察。进行照明和观察。 聚光镜中央有挡光片，聚光镜中央有挡光片，视视野背景是黑的野背景是黑的，只允许被，只允许被标本反射和衍射的光线进标本反射和衍射的光线进入物镜，物体边缘是亮的。入物镜，物体边缘是亮的。 可观察可观察 4200nm的微粒的微粒子，分辨率比普通显微镜子，分辨率比普通显微镜高高50倍。倍。 采用组合方式，集采用组合方式，集普通光镜、相差、普通

12、光镜、相差、荧光、暗视野、摄荧光、暗视野、摄影装置于一体；影装置于一体； 自动化与电子化自动化与电子化。（一）电子显微镜的基本知识（一）电子显微镜的基本知识1、基本构造、基本构造电子束照明系统：电子束照明系统：电子枪电子枪聚光镜聚光镜成像系统成像系统物镜物镜中间镜中间镜投影镜投影镜真空系统真空系统记录系统记录系统（电磁透镜）（电磁透镜）电子显微镜的分辨率为电子显微镜的分辨率为0.2nm，放大倍数可达百，放大倍数可达百万倍；万倍；2.电子显微镜与光学显微镜的基本区别电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨本分辨本领领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理光学光学显微显微镜镜200200nmnm10

13、0nm100nm可见光可见光( (波长波长400-700400-700nm)nm)紫外光紫外光( (波长波长约约200200nm)nm)玻璃玻璃透镜透镜玻璃玻璃透镜透镜不要不要求真求真空空利用样品对光利用样品对光的吸收形成明的吸收形成明暗反差和颜色暗反差和颜色变化变化电子电子显微显微镜镜接近接近0.10.1nmnm电子束电子束( (波长波长0.01-0.90.01-0.9nm)nm)电磁电磁透镜透镜要求要求真空真空利用样品对电利用样品对电子的散射和透子的散射和透镜形成明暗反镜形成明暗反差差 切片厚度一般仅为切片厚度一般仅为4050nm固定：锇酸（固定：锇酸（OsO4）和戊二醛等；和戊二醛等；包

14、埋：环氧树脂；包埋：环氧树脂；切片：切片：染色：重金属盐；形染色：重金属盐；形成明暗反差成明暗反差电镜生物样品制备过程电镜生物样品制备过程固定清洗后系列梯度清洗后系列梯度丙酮或酒精脱水丙酮或酒精脱水浸泡于稀浸泡于稀包埋剂中包埋剂中包埋剂包埋剂样品杆样品杆用玻璃刀或用玻璃刀或钻石刀切片钻石刀切片切片机切片机修块修块包埋块包埋块置温箱中包置温箱中包埋剂聚合埋剂聚合收集切片收集切片于载网上于载网上重金属染色置重金属染色置电镜下观察电镜下观察 用重金属盐用重金属盐(如磷钨如磷钨酸酸) 染色；吸去染料染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，铺了一层重金属盐，而凸出的地方没有染

15、而凸出的地方没有染料沉积，从而出现负料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达染效果，分辨力可达1.5nm左右。左右。Negative Stained Archaebacteria 将标本在标本台上于将标本在标本台上于196的液氮中超低温的液氮中超低温迅速冰冻；防止形成冰晶。迅速冰冻；防止形成冰晶。 用冷刀将冻结的标本骤然断开用冷刀将冻结的标本骤然断开； 当温度上升后，冰在真空条件下迅速当温度上升后，冰在真空条件下迅速升华升华，断，断裂面上的结构得以暴露裂面上的结构得以暴露（蚀刻）（蚀刻）； 再喷涂上一层蒸气再喷涂上一层蒸气铂和碳铂和碳； 将样品本身溶解掉，把喷涂上的碳和铂的膜剥将样品本身溶解掉，把

16、喷涂上的碳和铂的膜剥离下来离下来（复膜）（复膜）； 电镜观察。电镜观察。培养细胞内面的深度蚀刻电镜照片，示 Clathrin衣被工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出样品表面激发出二次电子二次电子，二次电子的多少与样，二次电子的多少与样品表面形貌有关，二次电子由探测器收集，信号品表面形貌有关，二次电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。与电子束同步的扫描图像。 CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题

17、问题 为了使标本表面发射出二次电子信号，标本在固为了使标本表面发射出二次电子信号，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜。定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜。Red blood cell Yeast 人类精子人类精子 原理：利用量子力学中的原理：利用量子力学中的隧道效应隧道效应 （通常在低压下，二电极之间有很大的阻抗，阻止（通常在低压下，二电极之间有很大的阻抗，阻止电流通过，称为叠势）电流通过，称为叠势） 当二电极之间近到一定距离（当二电极之间近到一定距离（100nm以内）时，以内）时，电极之间产生了电流，称为电极之间产生了电流，称为隧道电流隧道电流，并且隧道电流，并且隧道电流和针尖与样品之间

18、的和针尖与样品之间的间距间距呈呈指数指数关系。将扫描过程中关系。将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。形态。 特点：特点： 1. 原子尺度的高分辨率；原子尺度的高分辨率； 2. 可在真空、大气、液体等多种条件下工作；可在真空、大气、液体等多种条件下工作； 3.非破坏测量；非破坏测量；扫描隧道显微扫描隧道显微镜观察的镜观察的DNA双螺旋结构双螺旋结构STM image of a DNA molecule二、二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类 与脂质等的显示方法与脂质等的显示方法三、放射自显影技术三

19、、放射自显影技术四、分子杂交技术四、分子杂交技术五、定量细胞化学分析技术五、定量细胞化学分析技术 差速离心差速离心 密度梯度离心密度梯度离心 是分离细胞器及各种大分子基本手段。是分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速转速1025kr/min的离心机称为的离心机称为高速离心机高速离心机。 转速转速30kr/min，离心力，离心力89Kg者称为者称为超速离超速离心机心机。 超速离心机的最高转速可达超速离心机的最高转速可达150000r/min，离，离心力超过心力超过500kg。 方法：方法： （一）差速离心（一）差速离心 利用不同的离心速度所产生的不同的离心力，利用不同的离心速度所产生的不同的离心

20、力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。原理原理 : 在一定的离心速度下，不同大小的细胞器由在一定的离心速度下，不同大小的细胞器由于体积的不同，沉降的速度也不同，体积大的沉降的于体积的不同，沉降的速度也不同，体积大的沉降的快，反之沉降的慢。快，反之沉降的慢。用途用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 结构结构 离心力离心力 细胞核细胞核 8001000g 线粒体线粒体 20,000-30,000g 叶绿体叶绿体 20,000-30,000g 溶酶体溶酶体 20,000-30,000g 微体微体 20,000-30,000g粗面内质网粗

21、面内质网 50,000-80,000g质膜和光面内质网质膜和光面内质网 80,000-100,000g游离核糖体、病毒粒子游离核糖体、病毒粒子 150,000-300,000g不同的细胞结构分离所需的离心力沉降顺序：核沉降顺序：核线粒体线粒体溶酶溶酶体与过氧化物酶体体与过氧化物酶体内质网与高基内质网与高基体体核蛋白体。核蛋白体。 用介质在离心管内形成一连续或不连续的用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度密度梯度，将分离的细胞组分小心置于介，将分离的细胞组分小心置于介质的顶部，通过离心力场的作用使样品中质的顶部，通过离心力场的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同不同组分以不同的

22、沉降率沉降，形成不同的沉降带，从而将细胞成分分层、分离。的沉降带，从而将细胞成分分层、分离。 类型：类型：速度沉降、等密度沉降速度沉降、等密度沉降。 常用介质：常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 用途用途：分离密度相近而大小不等的细胞组：分离密度相近而大小不等的细胞组分。分。 特点特点：介质密度较低。：介质密度较低。 原理原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。 用途用途：分离密度不等的颗粒。：分离密度不等的颗粒。 特点特点：1）介质密度高，陡度大，介质最高密度）介质密

23、度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。大于被分离组分的最大密度。2）力场比速度沉降法大）力场比速度沉降法大10100倍，需要高速或倍，需要高速或超速离心。超速离心。 原理原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。分离。二、二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类与脂质等的显示方法质等的显示方法 为了测定蛋白质、核酸、多糖和脂类等细为了测定蛋白质、

24、核酸、多糖和脂类等细胞组分，常利用一些胞组分，常利用一些显色剂显色剂与所检测物质中与所检测物质中特殊基团的特异性结合，通过显色剂在细胞特殊基团的特异性结合，通过显色剂在细胞中出现的部位和颜色显示的程度，从而判断中出现的部位和颜色显示的程度，从而判断被检物质在细胞中的分布和含量。被检物质在细胞中的分布和含量。 DNA Feulgen反应反应多糖多糖 PAS反应反应 如淀粉、纤维素及动物如淀粉、纤维素及动物 细胞中的糖原、粘蛋白等。细胞中的糖原、粘蛋白等。脂类脂类 苏丹染色等苏丹染色等蛋白质蛋白质 Millon反应反应 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中

25、的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。作用部位等等。原理：原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。胶，经放射性曝光，使乳胶感光。 一般用一般用14C和和3H标记。常用标记。常用3H-TDR来显示来显示DNA，用，用3H-UDR显示显示RNA；用；用3H氨基酸研究蛋氨基酸研究蛋白质，用白质，用3H甘露糖、甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。岩藻糖研究多糖。14C半衰期为半衰期为5730年，年，

26、3H为为12.5年。年。 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。核苷酸序列间是否具有互补关系。 原位杂交原位杂交（in situ hybridization）。）。 用于检测染色体上的特殊用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。探针，后来又发明了免疫探针法

27、。人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 （一）（一）显微分光光度测定技术显微分光光度测定技术利用细胞内某些物质对特异光谱的利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质，吸收，测定这些物质，如核酸与蛋白如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。质等）在细胞内的含量。 包括：包括：紫外光显微分光光度测定法紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法可见光显微分光光度测定法主要应用：主要应用： 用于定量测定细胞中的用于定量测定细胞中的DNADNA、RNARNA或某一特或某一特 异蛋白的含量；异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特

28、异染色的细胞；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离分离DNADNA含量不同的中期染色体。含量不同的中期染色体。 2000V2000V高压偏转板高压偏转板充以正电充以正电的小水滴的小水滴充以充以负电负电的小的小水滴水滴分别收集细胞分别收集细胞激光激光排列成单列的细胞通排列成单列的细胞通过激光束时，仪器可过激光束时，仪器可测定出标记细胞上的测定出标记细胞上的荧光强度；荧光强度；仪器使带有荧光细胞仪器使带有荧光细胞的小水滴充电；的小水滴充电；带电水滴通过高压偏带电水滴通过高压偏转板偏离原来方向，转板偏离原来方向，收集细胞；收集细胞；未含标记的细胞或不未含标记的细胞或不含有细胞的水滴不偏含有细胞

29、的水滴不偏转。转。水滴水滴充电充电信号信号 第三节第三节 细胞培养、细胞工程技细胞培养、细胞工程技术与显微操作技术术与显微操作技术一、细胞培养一、细胞培养 细胞培养技术是细胞生物学研究方法中细胞培养技术是细胞生物学研究方法中最有价值的技术，通过细胞培养可以获得大最有价值的技术，通过细胞培养可以获得大量的细胞，也可通过细胞培养研究细胞的运量的细胞，也可通过细胞培养研究细胞的运动、细胞的信号传导、细胞的合成代谢等动、细胞的信号传导、细胞的合成代谢等。 体外培养细胞必须注意三个环节：体外培养细胞必须注意三个环节： 物质营养：由培养基提供。物质营养：由培养基提供。 物质营养、生存环境和废物物质营养、生

30、存环境和废物的排除。的排除。1、原代培养、原代培养 原代培养是指直接从机体取下细原代培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。胞、组织和器官后立即进行培养。但一般通常把第一代至第十代以内但一般通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为的培养细胞统称为原代细胞培养原代细胞培养。 （一）动物细胞培养（一）动物细胞培养2、细胞系和细胞株、细胞系和细胞株原代培养经首次传代成功后即为原代培养经首次传代成功后即为细胞系细胞系细胞细胞系系传至传至50代后，许多细胞不能再传下代后，许多细胞不能再传下去，但有少部分细胞发生遗传突变，可在去，但有少部分细胞发生遗传突变，可在培养条件下无限制地传下去培养条

31、件下无限制地传下去，这种传代细这种传代细胞称为胞称为永生细胞系永生细胞系。 10代代 原代培养原代培养 50代代 传代培养传代培养 遗传物质不变，接触抑制遗传物质不变，接触抑制 （细胞系细胞系） 传代培养传代培养 遗传物质发生变化，无接触抑制遗传物质发生变化，无接触抑制 3、 动物细胞培养方法动物细胞培养方法贴壁培养贴壁培养 分散的细胞悬浮在培养瓶中很快就贴分散的细胞悬浮在培养瓶中很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的附在瓶壁上，称为细胞贴壁，贴壁后的细胞形态形成多态性，呈单层生长，所细胞形态形成多态性，呈单层生长，所以此法又叫以此法又叫单层细胞培养单层细胞培养，单层培养的，单层培养的细胞

32、保持细胞保持接触抑制接触抑制的特性。的特性。悬浮培养悬浮培养 悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长，如一直悬浮在培养液中生长，如T细胞的培细胞的培养就是如此。悬浮培养的条件较为复杂，养就是如此。悬浮培养的条件较为复杂，难度也较大，但是容易同时获得大量的培难度也较大，但是容易同时获得大量的培养细胞。养细胞。 单倍体细胞培养单倍体细胞培养：花药：花药 原生质体培养原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁掉细胞壁 原生质体原生质体 (三三)非细胞体系非细胞体系：由来源于细胞，而不具有：由来源于细胞，而不具有完整的细胞结

33、构与成分，但包含了进行正完整的细胞结构与成分，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系。酶反应体系等）组成的体系。 用于用于DNA复制，复制，RNA转录，蛋白质合成，转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡运输，细胞核装配等高尔基体的膜泡运输，细胞核装配等 细胞提取物，细胞核提取物细胞提取物，细胞核提取物二、二、 细胞工程细胞工程（一）细胞融合（一）细胞融合细胞融合细胞融合是指自发或人工诱导下，两个或多是指自发或人工诱导下，两个或多个细胞融合形成一个双核或多核细胞的现象。个细胞融合形成一个双核或多核细胞的现象。 自发的动物细胞融合几

34、率很低，自发的动物细胞融合几率很低，1962年年Okada和和Tadokoro发现灭活的发现灭活的仙台病毒仙台病毒有促进细胞融合的作有促进细胞融合的作用。用。病毒外壳上的病毒外壳上的糖蛋白糖蛋白具有促进细胞融合的功能。具有促进细胞融合的功能。聚乙二醇聚乙二醇也有促进细胞融合的功能。也有促进细胞融合的功能。（二）（二） 单克隆抗体单克隆抗体 19751975年英国科学家年英国科学家Milstein和和Kohler将产生抗体将产生抗体 的的淋巴细胞淋巴细胞同同肿瘤细胞融合肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗，成功建立了单克隆抗 体技术，而获得体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。年诺贝尔医学和生理学奖。 每个每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某 种抗原决定簇的种抗原决定簇的特异性抗体特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限，而肿瘤细胞可以无限 增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内增殖，因