脂肪酶的概述及应用

1、脂肪酶的概述与应用一脂肪酶概述、脂肪酶（Lipase,甘油酯水解酶）隶属于竣基酯水解酶类，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。包括磷酸酯酶、固醇酶和竣酸酯酶。脂肪酸广泛的应用于食品、药品、皮革、日用化工等方面脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蔗麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物

2、的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara;Schmid）。脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同（Veerarag

3、avan等）。总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性（Schmid等；Kazlauskas等）。脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv就发现了这一现象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。这是脂肪酶区别于酯酶的一个特征。酯酶（EC3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最适底物是由短链脂肪酸（98）形成的酯。脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂

4、肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键，使甘油三酯降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是霉菌和细菌。已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种，其中18种来自霉菌，7种来自细菌。脂肪酶可将甘油酯(油、脂)水解，在不同阶段可

5、释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。水解生成的脂肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。二脂肪酶的结构解析1、分子结构研究表明，来源不同的脂肪酶，其氨基酸组成数目从270641不等,其分子量为29000100000。迄今为止,人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达,并利用X-衍射等手段和定向修饰等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数，确定了组成脂肪酶活性中心的三元组(triad)结构。表1列出了几种常见的脂肪酶的结构特征参数。正如下表所示，多数酶都有变种(如CCL(A)和CCL(B)、GCLI和GCLII等)，不过这些不同变种的酶具有绝大多数相同的氨基酸序列，其氨基酸组成

6、数目完全相同，不同的只是个别氨基酸的差异。一般而言，不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同，而且位置不变；其分子量和等电点略有不同。表I部分脂肪酶的结构特征参数脂肪防名称锐基酸残基数分子最道尔顿)尺度(10"小三元组催化中心P1向"H：川153457223(A)57744(B)M9X97.5X175.5Hi449)-Ser<209H；h(34l)4449m产544600006&X60X45(|)59一4X耶'*II)Hib(4A3)-Ser(217)-Glu£364)4.56437.6IA1(我以(MHL)269西47371.6X75X55S

7、cr(144>HM2671皿网449嘏3XJ3.办122.1Ser(l52Mlb<263)-A(176)注:CCL(CandidaCylindraceaLipase)；CBL(CmulldaRiigiMaLipase)(GCLCGeotnchumQiulidumLiw"HWLCRhissomuctirMidieiLipam1MMUMucorMiehdhPUhundt】ncitalicIi2、脂肪酶催化中心三元组研究表明，尽管不同来源的脂肪酶有不同的氨基酸组成(残基数目、分子量、三维空间结构等)，但由于生物的同源性和进化过程的保守性，具催化中心拥有相似或相同的特征区His-

8、X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸）。如图1所示，绝大多数脂肪酶的活性中心都由Ser和His参与组成，His、Ser与另一种氨基酸残基（如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等）一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组（triad）。如图2所示图I脂肪酶二级结构的般形式图2Candidarugpsalipase多肽的拓扑和立体图解3、立体结构具体参数方法:ExperimeAtalDataSnapghEMethodX-RAYDl-FRACTIONRe专OlutiOh135AR-ValueFree0147RValueW

9、ork0114WwPDBValidlatiohMetricClashaKreSkfechanounlierBFullReport三.脂肪酶的纯化与表达pPIC9k-mRCL表达质粒的构建1.以华根霉基因组DN刖模板使用PC昉法扩增RCL（华根霉脂肪酶全基因）成熟肽，扩增的基因片段纯化后克隆到载体pMD19-TVector中，转化E.coli.DH5%及进行重组质粒的筛选，由此构建重组质粒pMD19-mRCL2,由质粒pMD19-mRC切下目的基因片段，连入表达载体pPIC9k构建表达质粒pPIC9k-mRCL。(1)质粒双酶切克隆的质粒pMD19-mRCLS酵母表达质粒pPIC9k分别被Avr

10、II和NotI双酶切，得到pMD19-mRCL粒双酶切的800bb左右的小片段以及pPIC9k质粒的双酶切线性质粒大片段，回收目的条带。(2)连接载体DNA与目的DNA片段混合连接。(3)转化E.coli.DH5%及重组质粒的筛选重组质粒pPIC9K-mRCL勺构建重组蛋白在巴斯德毕赤酵母GS115中的初步表达1 .巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备2 .巴斯德毕赤酵母的电转化对质粒线性化，回收酶切产物；再与巴斯德毕赤酵母感受态细胞混匀，电转化得到含目的基因的重组巴斯德毕赤酵母3 .重组巴斯德毕赤酵母的鉴定可用浓度梯度进行抗性筛选4 .巴斯德毕赤酵母表达脂肪酶甲醇诱导重组蛋白的表达巴斯德毕赤酵母表

11、达系统的优点（选择的原因）：1.毕赤酵母是需氧酵母菌，在有氧条件下能高密度生长，因此有利于扩大生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失;且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株3、毕赤酵母甲醇氧化酶（alcoholoxidase,AOX理因的强启动子特别适用于外源基因的调控表达4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N一乙酰糖基化修饰的结构为高甘露糖型，糖链平均为814个甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含1,3连接的甘露糖残基（有强

12、的免疫原性），因而适用于临床应用6、使用方便、简单，而且成本较低4.表达后的纯化步骤：对象：重组巴斯德毕赤酵母过程：1 .摇瓶甲醇诱导培养2 .脂肪酶的分离纯化(1)10KD超滤膜浓缩将mRC发酵液离心后弃掉沉淀，上清液用微孔滤膜过滤，微滤后的溶液用10KD超滤膜浓缩。浓缩酶液用缓冲液透析过夜。(2)强阳离子交换柱层析将透析液上样到已用上述缓冲液预平衡的强阳离子交换柱层析(1.6cmX20cm),用相同缓冲洗脱未吸附蛋白。后用NaCl浓度梯度缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，一定的洗脱速率和时间分部收集，集中脂肪酶活性组分，用缓冲液透析。3)疏水色谱柱层析将透析后的酶液继续用疏水柱层析(1.6cmX20

13、cm)层析，用相同缓冲液洗脱除去未吸附蛋白。然后用硫酸镂浓度梯度差缓冲液阶段洗脱吸附蛋白，最后用H2O洗脱，一定的洗脱速率和时间分部收集，集中脂肪酶活性组分，透析除盐。4)得到脂肪酶活性组分mRCL四.脂肪酶的化学修饰设计思路脂肪酶作为一种水解酶，不仅催化水解反应而且催化有机相中酯合成和酯交换反应。有机相酶催化技术自20世纪80年代开创以来，已获得了巨大的发展，广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。近几年来人们为了提高酶在有机相中的溶解性及稳定性，在酶的化学手段修饰和生物学手段修饰方面开展了许多工作1-6。而化学修饰是提高和改变酶催化性能的有效方法。Basri等7用氨基酯的盐酸盐对脂肪酶进行化学

14、修饰，发现修饰酶在有机溶剂中的溶解度、热稳定性和催化酯化反应活性都有很大提高。TatsuoMaruyama等8用硬脂酸修饰了脂肪酶，发现虽然水解活性下降，但酯化活性明显提高。从文献来看，就化学修饰改善酶催化功能方面而言，以前主要研究了修饰酶在有机相(均相)中的稳定性、催化活性等问题，而涉及非均相界面催化的研究甚少。表面活性剂是一类兼具亲油基和亲水基的两亲物质，它能富集于界面从而显著地改变界面性质。修饰原理当水溶性的酶分子中引入长链烷基后，便具有了类似于表面活性剂的两亲结构。因此与未经修饰的酶相比，修饰后的酶疏水性增强，界面活性提高，从而有利于在有机相或界面催化化学反应，这对于酶的实际应用具有重

15、要意义。本文从界面化学的角度对用N-羟基琥珀酰亚胺活化的硬脂酸修饰的Lipolase脂肪酶的界面化学性质进行了研究，重点考察了修饰酶降低表/界面张力的能力及界面催化活性。1实验材料与方法1.1 化学试剂及仪器化学试剂：Lipolase100L,诺维信（中国）生物技术有限公司生产；N羟基琥珀酰亚胺，为生化试剂；硬脂酸及其他试剂，为国产分析纯试剂，购自中国医药（集团）上海化学试剂公司。仪器：冷冻干燥仪（79340018917z-01,USA,紫外可见分光光度计（UVIKONGermany）,元素分析仪（VarioEL,German,表面张力仪（DCA315USA）,界面张力仪（DVT30Germa

16、ny）及LB成膜装置LB5000（KSV5000Finland）。1.2 硬脂酸琥珀酰亚胺酯的制备活化后的硬脂酸易于与酶表面的氨基反应，因此先将硬脂酸活化。将硬脂酸溶入适量NN-二甲基甲酰胺（DMF）中，并加入一定比例的N羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳酰亚胺。三者摩尔比为1：2.25 :2.25910。磁力搅拌反应8h,反应温度为30C。反应结束后过滤，滤液用乙醴萃取。蒸去乙醴得到白色固体，然后用无水乙醇反复洗涤后经真空干燥即得。1.3Lipolase脂肪酶的化学修饰在磁力搅拌下，将Lipolase100L用透析袋于去离子水中透析2天，冷冻干燥得到白色固体酶晶体。固体酶置于5C冰箱中储存备用。30

17、0mg固体酶溶于20mL磷酸二氢钾-硼砂缓冲液（pH=7.4）,将200mg硬脂酸琥珀酰亚胺酯溶于5mLDMF后逐滴加入酶溶液。10C下反应10h。反应完毕后，混合物在4000r/min下离心15min除去未反应的酯，重复操作两次。上清液用透析袋于去离子水中透析一周后冷冻干燥，干燥后的产物即为修饰酶。1.4:修饰度的测定由于在Lipolase表面引入烷基，所以修饰酶中酶含量降低，而酶中含氮量固定，故修饰后总含氮量降低。测定酶修饰前后的含氮量，其差值相对含量定义为修饰度。酶的平均含氮量由元素分析仪测定。实验测得未修饰酶的平均含氮量为14.2%。2.26 Lipolase脂肪酶酶活测定水解活力采用

18、橄榄油乳化液法测定11一；酯化活力按M.Basri等的方法进行“司。界面水解活力的测定按如下方法进行：在50mL锥形瓶中加入10mL一定浓度的酶溶液（浓度:0.11g/L）,37C预热5min,再加入2mL橄榄油，低速磁力搅拌，橄榄油在Lipolase的催化下在界面水解。生成的脂肪酸的量采用酸碱滴定法测定。2.27 Lipolase脂肪酶水溶液的表/界面张力测定Lipolase脂肪酶水溶液的表面张力采用吊片法测定14。正己烷-酶水溶液体系的界面15张力采用滴体积法测定。1.7Lipolase脂肪酶LB膜的制备选择水-异丙醇-氯仿为铺展剂1618,三者体积比为5：6：1。亚相为用超纯水配制的5%

19、KCl盐溶液。用微量注射器将酶溶液铺展于亚相表面，待溶剂挥发30min后用LB成膜装置压膜，压膜速率为3cm/min,同时得到口-A曲线。2结果与讨论2.1 Lipolase脂肪酶的水解活性图1为温度对Lipolase催化橄榄油水解酶活的影响。由图1知，Lipolase最适水解温度约为37C,虽然修饰后水解酶活有所降低，但并不改变8Lipolase的最佳水解温度，这与文献报道一致。相同温度下的酶活随修饰度的增加而下降。修饰酶中酶的质量分数下降、修饰过程中酶的活力损失等均可能是水解酶活降低的原因之一；由于硬脂酸的引入使得Lipolase酶活部位的空间结构发生变化也可能导致Lipolase失活。五

20、.脂肪酶的应用1、酶在食品工业酶在食品工业中具有广泛而重要的作用，近年来人们对脂肪酶的研究取得了很大的进展，已引起了全世界的广泛关注。目前，脂肪酶在非水体系中反应的研究在国外已取得突破性进展，脂肪酶的应用已深入到食品工业中的多个领域，国内脂肪酶在非水介质中的酶促反应亦成为近几年的研究热点，并取得一些可喜的成果。当前，由于固定化酶的方法过于复杂，效率低、成本高，或使用了有毒的化学试剂而不符合食品加工所必须满足的经济和安全的标准，所有这些都限制了固定化脂肪酶技术在食品工业中的应用，但随着生物技术以及材料、化工等各相关学科的发展，相信固定化脂肪酶的工作会有新的突破。在食品中也将得到更广泛的运用，对促

21、进食品工业快速发展具有重要意义脂肪酶在焙烤食品中的应用随着焙烤食品工业的快速发展，消费者的食品安全和健康意识日益增强，对面粉及其制品提出了愈来愈高的要求。要想生产出好的面粉，就需要优质的原料，而我国小麦由于品质参差不齐，要想达到焙烤食品工业的要求，就要在面粉后处理中添加食品添加剂，来弥补面粉品质的不足。过去面包粉改良主要是化学改良剂，如澳酸钾，虽然它对面团及面包有较好的作用，但长期使用对人体有害，2005年7月1日被我国禁止使用。随着澳酸钾被禁用，如何使用天然无害具有替代功能的产品，成为广大焙烤食品及面粉企业关注的焦点，而生物酶制剂满足了这方面的要求。酶作为一种生物制品，在面粉改良中，具有显著

22、的优越性：酶本身就是活细胞产生的活性蛋白质不会留下有毒的物质；酶的催化作用具有高度的专一性，一种酶只对一种底物起作用，如淀粉酶只能催化淀粉的水解，而对蛋白质则无效。酶的催化效率非常高，比一般催化剂高1071013倍，因此用量相当少；酶的操作条件温和，在常温、常压下就能进行。脂肪酶是酶制剂的一种，酶的所有特Tt它都具有，与其它酶制剂如葡萄糖氧化酶复配后能够取代化学增筋剂澳酸钾。它能够提高面制品的烘焙品质、改善面包质地、延长制品的货架期。脂肪酶能催化甘油三酯水解生成甘油二酯，甘油一酯或甘油。它对面团有强筋作用，能够提高面包的入炉急胀增大面包体积，且对面包芯有二次增白作用。它符合了焙烤食品工业绿色、安全、健康的发展要求，正愈来愈受到广大焙烤食品及面粉企业的欢迎，相信它在这些领域的应用具有更加广阔的前景。脂肪酶在乳品工业中的应用应用于乳酯水解，包括奶酪和奶粉风味的增强、奶酪的熟化、代用奶制品的生产、奶油及冰淇淋的酯解改性等。脂肪酶作用于乳酯并产生脂肪酸，能赋予奶制品独特的