细菌生化反应原理

1、细菌生化反应原理一、细菌的生化试验各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。用生物化学反应方法测定这些代谢产物，称为细菌的生化试验或生化反应。细菌的生化试验可用来区别和鉴定细菌。生化试验主要包括以下几大类蛋白质的代谢试验、碳水化合物的代谢试验氨基酸利用实验氮源利用试验碳源利用实验酶类试验（一）、基本要求结果观察有的生化反应直接能观察到结果，如糖、醇、发酵试验，通过PH改变和指示剂变化来提示是否阳性和阴性反应；尿素分解试验，生化管变红即是阳性；硫化氢试验，培养基不同，结果观察方法有异。生化管中有黑色沉淀或双糖铁/三糖铁管中有黑色产生即表示阳性；有的生化反应需要在3

2、5摄氏度培养箱中孵育后另外加其他试剂才能判断结果，如靛基质试验、甲基红试验、VP试验、苯丙氨酸试验等。（二）碳水化合物的代谢试验1.糖（醇、昔）类发醉试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖、醇、甘类的酶，因而对各种糖、醇、甘类的代谢能力也不同，即使能分解某种糖、醇、甘类，其代谢产物菌种不同而异。有的分解糖类只产酸不产气，有的既产酸又产气，检查细菌对培养基中所含糖、醇、甘降解后产酸或产酸产气的能力，可用于鉴定细菌种类。一般常用的指示剂为酚红、澳甲酚紫、澳百里蓝和Aadrade指示剂。（2）结果：能分解糖、醇、甘类产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色、澳甲酚紫变为黄色）；不分

3、解糖则应无变化。（3）美华的鉴定板肠杆菌、葡萄球菌、链肠球菌糖醇类所用的指示剂为澳甲酚紫、如果细菌能分解这些糖醇类，则培养基呈酸性反应即培养基呈黄色（阳性），如果不分解则显示紫色（阴性）。澳甲酚紫指示剂酸性颜色为黄色，碱性颜色为紫色。（3）应用：糖、醇、甘类发酵试验，是鉴定细菌生化反应中的关键的试验，不同细菌可发酵不同的糖、醇、甘类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，具发酵结果页不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此实验鉴定和鉴别细菌。2.革兰阴性杆菌葡萄糖代谢类型鉴别实验

4、(O-F实验)(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧讲解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型的细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵试验，可用于细菌的代谢类型。(细菌分解葡萄糖的过程可分为三大类：氧化型、发酵型、产碱型)(2)应用：主要用于肠杆菌科细菌与其他非发酵菌的鉴别。肠杆菌科，弧菌科细菌为非发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。3 .beta半乳糖昔没试验(ONPG)(1)原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和beta半乳糖甘酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖甘酶，因而只能迟缓发

5、酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-B-D-半乳糖甘(ONPG)而生成黄色的邻硝基酚。(2)培养基(ONPG)培养基(3)应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸椽酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼菌属、沙门菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。4 .甲基红(MR)试验(1)原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酸酮酸，丙氨酸可进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的PH降至4.5一下，当加入甲基红试剂则呈红色，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，

6、或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醍、气体和水等)。则培养基的PH仍在6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。(2)方法：将待检细菌接种于上述培养基，35摄氏度孵育24日，于培养基内加入2滴甲基红试剂，立即观察结果。(3)结果：红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。(4)应用:主要用于大肠埃希菌和运动克雷伯菌的鉴别。前者阳性，后者阴性，此外，肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、变形杆菌属、枸椽酸杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼菌属、克雷伯菌属则为阴性。5 .V-P试验(1)原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱竣产生乙酰甲基甲醇

7、，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化为二乙酰，进而与培养基内蛋白月东中精氨酸所含的服基起作用，生成红色化合物，则为VP实验阳性。若培养基中服基含量较少，则可加入少量含服基化合物，如肌酊或肌酸等。实验时加入a-蔡酚可加速此反应。(MH公司产品对应能提供碱性环境的是VPB,VPA是a-蔡酚)(2)(2)培养基：葡萄糖蛋白月东水培养基(3)应用：主要用于大肠埃希菌和运动克雷伯菌的鉴别。本实验常与MR实验一起使用，一般情况下，前者(MR)为阳性的细菌，后者(V-P)常为阴性，反之亦然。如大肠埃希菌，沙门菌属、阴沟上杆菌等，V-P反应阳性，而甲基红反应阴性。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房

8、哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的V-P实验和MR实验常同为阳性。6.七叶昔水解实验(1)原理：有的细菌可将七叶甘(也称七叶灵)分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中枸椽酸铁的二价离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。(2)培养基;七叶甘培养基(3)应用：主要用于革兰阴性杆菌、厌氧菌及肠球菌属的鉴定。克雷伯菌属、肠杆菌属和沙雷菌属能水解七叶甘，肠球菌属和D群链球菌也能水解七叶甘并耐受胆汁。三、氨基酸和蛋白质的代谢实验不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的的蛋白质分解为短肽(或氨基酸)，渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。1.阻噪试验(1)原理：某

9、些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白月东水中的色氨酸生成呻噪(靛基质)，呻噪与对二甲基苯甲醛结合，形成玫瑰呻噪，为红色化合物。当加入呻噪试剂(对二甲氨基苯甲醛)后则形成红色的玫瑰呻噪。(对应公司产品：IND辅助试剂成分是对二甲氨基苯甲醛)(2)培养基：蛋白月东水培养基(3)应用：主要用于肠杆菌细菌、非发酵菌、苛养菌和厌氧菌的鉴定。2.硫化氢实验(1)原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸(如胱氨酸、半胱氨酸)产生硫化氢，硫化氢遇铅或亚铁离子则形成黑褐色的硫化铅或硫化铁沉淀。此实验可间接检测细菌是否产生硫化氢。(公司目前用的含硫物质是硫代硫酸钠)(2)培养基：醋酸铅培养基3 .应用：主要用于肠杆菌科

10、中属及种之间的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸椽酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性明胶液化实验(1)原理：明胶是胶原蛋白经适度降解变性而得到的产物。某些细菌可产生一种胞外酶明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，破坏胶原而失去凝固力，使半固体的明胶培养基成为流动的液体。(2)培养基：营养明胶培养基，黑色明胶颗粒培养基应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙门菌，普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟形杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜菌、脆弱等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。4 .氨基酸脱竣酶实验(1)原理：变形杆菌科细菌能使多种氨基酸氧化脱

11、氨基生成a-酮酸，加入三氯化铁试剂后可呈现不同的颜色反应。如异亮氨酸、正亮氨酸和缴氨酸氧化脱氨后为橙色反应，甲硫氨酸氧化脱氨后为紫色反应，亮氨酸氧化脱氨后变为灰紫色反应，组氨酸氧化脱氨后为绿色反应，苯丙氨酸氧化脱氨后生成丙酮酸为深绿色反应，色氨酸氧化脱氨后生成呻噪3-丙酮酸为深褐色反应并久不褪色(可作为一项替代反应如API20E中的TDA实验)(2)培养基：苯丙氨酸琼脂培养基，色氨酸液体培养基供氨基酸脱氨酶实验的培养基不能猛用牛肉膏和蛋白月东配制(因其含有多种氨基酸)，应采用酵母浸膏作为氮源和碳源。(3)试剂：苯丙氨酸脱氨酶用10%三氯化铁(色氨酸脱氨酶用TDA试剂，即3.4%三氯化铁)(4)

12、结果：苯丙氨酸出现绿色为阳性，应立即观察结果，延长反应时间会引起褪色。色氨酸出现深褐色为阳性反应。(5)应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。5 .氨基酸脱竣酶实验(1)原理：具有氨基酸脱竣酶的细菌，能分解氨基酸使其脱竣生成胺(懒氨酸-尸胺，鸟氨酸-腐胺，精氨酸-精胺)和二氧化碳，使培养基变碱指示剂变色。此反应在偏酸性条件下进行。(2)培养基：氨基酸脱竣酶培养基和氨基酸对照培养基(3)应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的懒氨酸和鸟氨酸脱竣酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，

13、其他志贺菌均为阴性。6 .精氨酸双水解酶实验(1)原理：精氨酸经两次水解后，生成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在脱竣酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均为碱性物质，故可使培养基变碱，用指示剂指示出来。(指示剂为酚红)(2)结果：澳甲酚紫指示剂显示紫色为阳性，酚红指示剂呈红色为阳性，黄色为阴性。(3)应用：主要用于肠杆菌科及假单胞菌属某些细菌的鉴定。7 .尿素酶试验(1)原理：某些细菌具有尿素酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂呈红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。(2)应用：主要用于件比尔尿素酶快速阳性的变形杆菌和肠杆菌科中的细菌。可区别变形(+)与

14、普罗威登斯菌(-);克雷伯菌属(+)与埃希菌(-)。摩根摩根菌阳性。也有利于其他菌种的鉴别和鉴定。四、碳源和氮源利用实验1 .枸檬酸盐利用实验(1)原理：某些细菌能利用枸椽酸盐作为唯一碳源，可在醋酸盐培养基上生长，分解醋酸盐生成碳酸钠，使培养基变碱性。(指示剂澳麝香草酚蓝，碱性颜色是蓝色，酸性颜色是绿色。对应板上CIT、MLT蓝色是阳性，黄色或绿色是阴性)(2)醋酸盐培养基(3)应用：肠杆菌科中埃希菌属为阳性，志贺菌属为阴性。铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌等也为阳性。2 .乙酰胺利用实验(1)原理：许多非发酵菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，使培养基变碱。(2)培

15、养基：乙酰胺培养基，加酚红指示剂。(3)应用：主要用于非发酵菌的鉴定。铜绿假单胞菌、脱硝无色杆菌、食酸戴尔夫特菌为阳性，其他非发酵菌大多数为阴性。3 .马尿酸盐水解实验(1)原理：某些细菌可具有马尿酸水解酶，可使马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成有颜色的苯甲酸铁沉淀。甘氨酸与苗三酮结合为蓝色反应(2)培养基：马尿酸钠培养基或1%马尿酸钠溶液。(3)应用：主要用于B群链球菌和嗜肺军团菌的鉴定。五：酶类实验1 .氧化酶实验(1)原理：氧化酶(细胞色素氧化酶)是细胞色素呼吸酶吸头的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对本二胺氧化，生成有色的酶类化合物，产生颜色反应。(2)结果：细菌与试剂接触呈深紫色为阳性，不变色为阴性。为保证结果的准确性，分别以铜绿假单胞菌27853和大肠埃希菌25922作为阳性和阴性对照。应用不锈钢或银丝时易出现假阳性结果。、(3)应用：主要用于肠杆菌细菌与假单胞菌的鉴别，前