第四章 酶蛋白的化学修饰

1、Enzyme Engineering酶工程酶工程第三章第三章 酶蛋白的化学修饰酶蛋白的化学修饰n第一节第一节 化学修饰的原理化学修饰的原理n第二节第二节 化学修饰的方法学化学修饰的方法学n第三节第三节 酶蛋白侧链基团的修饰酶蛋白侧链基团的修饰 n第四节第四节 酶的亲和修饰酶的亲和修饰 n第五节第五节 酶的化学交联酶的化学交联n第六节第六节 酶化学修饰的应用酶化学修饰的应用第一节第一节 化学修饰的原理化学修饰的原理 一、一、 酶的化学修饰原因酶的化学修饰原因1 1 稳定性不够，不能适应大量生产的需要。稳定性不够，不能适应大量生产的需要。2 2 作用的最适条件不符。作用的最适条件不符。3 3 酶的

2、主要动力学性质的不适应。酶的主要动力学性质的不适应。4 4 临床应用的特殊要求。临床应用的特殊要求。二、定义二、定义 酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，以达酶分子的化学修饰就是在分子水平上对酶进行改造，以达到到改构改构和和改性改性的目的。即在体外将酶分子通过人工的方法与一的目的。即在体外将酶分子通过人工的方法与一些些化学基团化学基团( (物质物质) )，特别是具有生物相容性的物质，进行，特别是具有生物相容性的物质，进行共价共价连接连接，从而改变酶的结构和性质。这种物质被称为，从而改变酶的结构和性质。这种物质被称为修饰试剂修饰试剂。化学修饰酶主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。化学修饰

3、酶主要用于基础酶学的研究和疾病治疗。三、酶化学修饰的基本原理三、酶化学修饰的基本原理1 1 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2 2 如何保护酶活性部位与抗抑制剂如何保护酶活性部位与抗抑制剂3 3 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4 4 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境影响酶化学修饰反应进程的因素主要有两个：影响酶化学修饰反应进程的因素主要有两个：|酶蛋白功能基的反应性酶蛋白功能基的反应性|修饰剂的反应性修饰剂的反应性影响酶化学修饰反应进程的因素：影响酶化学修饰反应进程的因素：

4、|酶蛋白功能基的反应性酶蛋白功能基的反应性F 微区的极性：是决定基团解离状态的关键因素之一。微区的极性：是决定基团解离状态的关键因素之一。F 氢键效应：蛋白质或其离子通过氢键来维持稳定性。氢键效应：蛋白质或其离子通过氢键来维持稳定性。 F 静电效应：带电基团之间的相互影响造成的。静电效应：带电基团之间的相互影响造成的。F 位阻效应：当烷基在空间上紧靠着蛋白的功能基，会使位阻效应：当烷基在空间上紧靠着蛋白的功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时会出现位阻效应。修饰剂不能与功能基接触，这时会出现位阻效应。酶蛋白功能基的酶蛋白功能基的超反应性超反应性：蛋白质的某个侧链基团与：蛋白质的某个侧链基团与

5、个别试剂能发生非常迅速的反应。但不一定是酶的活个别试剂能发生非常迅速的反应。但不一定是酶的活性部位基团。性部位基团。影响酶化学修饰反应进程的因素：影响酶化学修饰反应进程的因素：|修饰剂的反应性修饰剂的反应性F选择吸附选择吸附 ：修饰剂根据各自特点，选择性地吸附在低：修饰剂根据各自特点，选择性地吸附在低极性区域或高极性区，形成极性区域或高极性区，形成蛋白质修饰剂蛋白质修饰剂复合物。复合物。F静电相互作用：带电修饰剂可以选择性地吸引在蛋白静电相互作用：带电修饰剂可以选择性地吸引在蛋白质表面带质表面带相反电荷相反电荷的部位。的部位。(碘乙酸和碘乙酰胺烷基碘乙酸和碘乙酰胺烷基化的速度化的速度)F位阻因

6、素：位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正位阻因素：位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。常反应。(溴代酸的大小影响修饰）溴代酸的大小影响修饰）F催化因素：不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有催化因素：不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显差异，较大程度上与酶的酸碱催化有关。明显差异，较大程度上与酶的酸碱催化有关。F局部环境的极性：大多反应会与溶剂的极性有关，且局部环境的极性：大多反应会与溶剂的极性有关，且溶剂效应相当复杂。溶剂效应相当复杂。第二节第二节 化学修饰的方法学化学修饰的方法学 一、一、 修饰剂的要求修饰剂的要求二、二、 反应条件的选择反应条件的选择三、三、 酶性质的了解酶性质

7、的了解四、四、 酶修饰方法酶修饰方法一、一、 修饰剂的要求修饰剂的要求1 1 修饰剂的分子大小、修饰剂链的长度对蛋修饰剂的分子大小、修饰剂链的长度对蛋 白质的吸附性。白质的吸附性。2 2 修饰剂上反应基团的数目及位置。修饰剂上反应基团的数目及位置。3 3 修饰剂上反应基团的活化方法与条件。修饰剂上反应基团的活化方法与条件。 在酶蛋白不变性的条件下有选择性地与氨在酶蛋白不变性的条件下有选择性地与氨基酸残基反应，易分离修饰后的衍生物以便进基酸残基反应，易分离修饰后的衍生物以便进行测定。行测定。根据修饰目的、专一性而定根据修饰目的、专一性而定二、二、 反应条件的选择反应条件的选择 反应条件应尽可能保

8、证蛋白质特定空间构象不变反应条件应尽可能保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。或少变的情况下进行。 避免不可逆变性、有利于专一性修饰蛋白避免不可逆变性、有利于专一性修饰蛋白1 1 反应体系中酶与修饰剂的分子比例。反应体系中酶与修饰剂的分子比例。 酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。2 2 反应体系的溶剂性质，盐浓度和反应体系的溶剂性质，盐浓度和pHpH条件。条件。 pHpH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。于它们的解离状态不同，反应性能也不同。3 3

9、反应温度及时间。反应温度及时间。 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。专一性的修饰反应。三、三、 酶性质的了解酶性质的了解1 1 酶活性部位情况。酶活性部位情况。 活性中心基团、辅因子等。其他如分子大活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。小、性状、亚基数等。2 2 酶的稳定条件、酶反应最适条件。酶的稳定条件、酶反应最适条件。 热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pHpH、抑制剂等。抑制剂等。3 3 酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等。等。 修饰酶的

10、性质及特点修饰酶的性质及特点n热稳定性热稳定性n抗原性抗原性n体内半衰期体内半衰期n酶学性质的改变酶学性质的改变n最适最适pHn对组织的分布能力变化对组织的分布能力变化热稳定性热稳定性n热稳定性热稳定性增加增加q修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分子构象，增强了酶的热稳定性。强了酶的热稳定性。q增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活。增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活。 抗原性抗原性q 部分可部分可消除消除。PEG、人血清白蛋白在消除酶抗原、人血清白蛋白在消除酶抗原 性上效果明显。性上效果明显。 修饰酶的性质及特点修饰酶的性质及特点体内半衰期体内半衰期q体

11、内半衰期体内半衰期延长延长 修饰酶的性质及特点修饰酶的性质及特点酶学性质的改变酶学性质的改变q绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度没有改变，但有些酶在修饰后，米氏常数会但有些酶在修饰后，米氏常数会增大增大。修饰酶的性质及特点修饰酶的性质及特点 对组织的分布能力变化对组织的分布能力变化q对组织的分布能力有所改变，能在血液中被对组织的分布能力有所改变，能在血液中被靶器官选择性地吸收。靶器官选择性地吸收。最适最适pHq 有些酶经过化学修饰后，最适有些酶经过化学修饰后，最适pH发生变化。发生变化。修饰酶的性质及特点修饰酶的性质及特点四、四、 酶修饰方法酶修饰方

12、法n 酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰 n 有机大分子对酶的化学修饰有机大分子对酶的化学修饰n 蛋白质类及其他对酶的化学修饰蛋白质类及其他对酶的化学修饰第三节第三节 酶蛋白侧链的修饰酶蛋白侧链的修饰 一、几种重要的修饰反应一、几种重要的修饰反应 酰化反应酰化反应 烷基化反应烷基化反应 氧化和还原反应氧化和还原反应 芳香环取代反应芳香环取代反应二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰三、研究新热点三、研究新热点一、几种重要的修饰反应一、几种重要的修饰反应1 1酰化及其相关反应酰化及其相关反应2 2烷基化反应烷基化反应 3 3氧化和还原反应氧化和还原

13、反应 4 4芳香环取代反应芳香环取代反应 二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 1 1巯基的化学修饰巯基的化学修饰|巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能。性和功能。|常用修饰剂：烷基化剂、酰化基、常用修饰剂：烷基化剂、酰化基、 马来酰亚胺马来酰亚胺2 2氨基的化学修饰氨基的化学修饰|氨基容易被选择性修饰，氨基烷基化已氨基容易被选择性修饰，氨基烷基化已成为重要的赖氨酸修饰方法，化

14、学修饰也成为重要的赖氨酸修饰方法，化学修饰也常用于蛋白质序列分析（多肽链的常用于蛋白质序列分析（多肽链的N N端分端分析）析）。|常用修饰剂：卤代乙酸、芳香卤、磷酸常用修饰剂：卤代乙酸、芳香卤、磷酸 吡哆醛、吡哆醛、2 2，4 4二硝基氟二硝基氟 苯苯DNFBDNFB、丹磺酰氯、丹磺酰氯DNSDNS3 3羧基的化学修饰羧基的化学修饰 4 4咪唑基的化学修饰咪唑基的化学修饰 |组氨酸残基位于许多酶的活性中心，修组氨酸残基位于许多酶的活性中心，修饰剂焦碳酸二乙酯饰剂焦碳酸二乙酯DPCDPC对其有较好的专一性，对其有较好的专一性，修饰产物在修饰产物在240nm240nm处有最大吸收。处有最大吸收。|

15、常用修饰剂：碘代乙酸、焦碳酸二乙酯常用修饰剂：碘代乙酸、焦碳酸二乙酯DPCDPC（均能修饰咪唑环上的两个氮原子）（均能修饰咪唑环上的两个氮原子）5 5胍基的化学修饰胍基的化学修饰 |精氨酸残基的胍基在中性或弱碱性条件精氨酸残基的胍基在中性或弱碱性条件下能与修饰剂发生反应。下能与修饰剂发生反应。|常用修饰剂：具有两个临位羰基的化合常用修饰剂：具有两个临位羰基的化合物物丁二酮、苯乙二醛、丁二酮、苯乙二醛、1 1，2 2环己二环己二酮等。酮等。6. 6. 酚羟基的化学修饰酚羟基的化学修饰 |酪氨酸残基的酚羟基可被修饰。苏氨酸酪氨酸残基的酚羟基可被修饰。苏氨酸和丝氨酸残基的羟基也可被该类修饰剂修和丝氨

16、酸残基的羟基也可被该类修饰剂修饰，且产物更为稳定，但反应条件严格。饰，且产物更为稳定，但反应条件严格。四硝基甲烷四硝基甲烷TNMTNM在温和条件下高度专一性地在温和条件下高度专一性地硝化，生成可电离的发色物质，可用于氨硝化，生成可电离的发色物质，可用于氨基酸定量分析。基酸定量分析。|常用修饰剂：四硝基甲烷常用修饰剂：四硝基甲烷TNMTNM、碘、二异、碘、二异丙基氟磷酸酯丙基氟磷酸酯DFPDFP7. 7. 色氨酸吲哚基的化学修饰色氨酸吲哚基的化学修饰 |色氨酸残基的吲哚基比巯基、氨基反应色氨酸残基的吲哚基比巯基、氨基反应性差，性差，HNBB HNBB 和和4 4硝基苯硫氯对吲哚基修硝基苯硫氯对吲

17、哚基修饰比较专一。饰比较专一。KoshlandKoshland试剂试剂二甲基二甲基（2 2羟基羟基5 5硝基苄基）溴化锍硝基苄基）溴化锍,水溶水溶性好，有利于修饰酶，修饰色氨酸时应对性好，有利于修饰酶，修饰色氨酸时应对巯基进行保护。巯基进行保护。|常用修饰剂：常用修饰剂：N N溴代琥珀酰亚胺溴代琥珀酰亚胺NBSNBS、2 2羟基羟基5 5硝基苄溴硝基苄溴HNBBHNBB、4 4硝基苯硫硝基苯硫氯、氯、KoshlandKoshland试剂试剂三、研究热点三、研究热点- -核酸类酶的修饰核酸类酶的修饰 nRNARNA酶的侧链基团：指组成酶的侧链基团：指组成RNARNA的核苷酸残的核苷酸残基上的功能

18、团。主要是核糖基上的功能团。主要是核糖2-2-位置上的位置上的羟基和嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基。羟基和嘌呤、嘧啶碱基上的氨基和羟基。第四节第四节 酶的亲和修饰酶的亲和修饰 酶的位点专一性修饰是根据酶和底物的酶的位点专一性修饰是根据酶和底物的亲和性，试剂作用于亲和性，试剂作用于被作用部位的某一基团被作用部位的某一基团，而不与被作用部位以外的同类基团发生作用，而不与被作用部位以外的同类基团发生作用，这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂。这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂。具有具有与底物类似的结构，对酶活性部位有高度的与底物类似的结构，对酶活性部位有高度的亲和性，对活性部位的氨基酸残基可进行共亲和性，对

19、活性部位的氨基酸残基可进行共价标记。价标记。因此这类专一性化学修饰也称为因此这类专一性化学修饰也称为亲亲和标记或专一性的不可逆抑制。和标记或专一性的不可逆抑制。一、亲和标记一、亲和标记 用于亲和标记的亲和试剂应符合如下用于亲和标记的亲和试剂应符合如下条件条件：v 在使酶不可逆失活之前，亲和试剂要与酶形在使酶不可逆失活之前，亲和试剂要与酶形 成可逆复合物；成可逆复合物；v亲和试剂的修饰程度是有限的；亲和试剂的修饰程度是有限的；v没有反应性的竞争性配体的存在应减弱亲和没有反应性的竞争性配体的存在应减弱亲和 试剂的反应速度；试剂的反应速度；v亲和试剂体积不能太大，否则会产生空间障亲和试剂体积不能太大

20、，否则会产生空间障碍；碍；v修饰产物应当稳定，便于表征和定量。修饰产物应当稳定，便于表征和定量。n亲和标记分类亲和标记分类 K Ks s型不可逆抑制：型不可逆抑制：底物、竞争性抑制剂底物、竞争性抑制剂 对修饰有保护作用，反应定量定点进行。对修饰有保护作用，反应定量定点进行。 K Kcatcat型不可逆抑制：型不可逆抑制：专一性很高专一性很高二、外生亲和试剂与光亲和标记二、外生亲和试剂与光亲和标记 内生亲和试剂内生亲和试剂：试剂本身的某部分通过化学方法转：试剂本身的某部分通过化学方法转 化为所需要的反应基团，而对试化为所需要的反应基团，而对试 剂的结构没有大的扰动。剂的结构没有大的扰动。亲和试剂

21、亲和试剂 外生亲和试剂外生亲和试剂：把反应性基团加入到试剂中去。：把反应性基团加入到试剂中去。|光亲和试剂光亲和试剂是一类特殊的外生亲和试剂，它在结构上除是一类特殊的外生亲和试剂，它在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。这种了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。这种试剂先与酶活性部位在暗反应条件下发生特异性结合，然后试剂先与酶活性部位在暗反应条件下发生特异性结合，然后被光照激活，产生一个非常活泼的功能基团能与它们附近几被光照激活，产生一个非常活泼的功能基团能与它们附近几乎所有基团反应，形成一个共价的标记物。乎所有基团反应，形成一个共价的标记物。第五节第五节 酶的化

22、学交联酶的化学交联n定义：定义：酶的化学交联是一类重要的化学修酶的化学交联是一类重要的化学修饰。交联剂有两个反应活性部位的饰。交联剂有两个反应活性部位的双功能双功能基团基团可以在相隔较近的两个氨基酸残基之可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。间，或酶与其他分子之间发生交联反应。n分类：分类：交联剂分为交联剂分为同型双功能试剂、异型同型双功能试剂、异型双功能试剂和可被光活化试剂双功能试剂和可被光活化试剂三种类型，三种类型，每类又每类又可分为可裂解型可分为可裂解型和和不可裂解型不可裂解型。n同型双功能交联剂同型双功能交联剂两端具有相同的活性反应基团。两端具有相同的活性反应基团。n异型双功能交联剂异型双功能交联剂的一端与氨基作用，另一端一的一端与氨基作用，另一端一般与巯基作用（羧基）。般与巯基作用（羧基）。n可被光活化的高交联剂可被光活化的高交联剂一端与酶反应，经光照，一端与酶反应，经光照，另一端产生一个活性反应基团（自由基）。它们另一端产生一个活性反应基团（自由基）。它们具有高反应性，没有