基因工程专题(1)ppt课件

1、优秀精品课件文档资料4.目的基因的检测与鉴定：目的基因在受体细胞中目的基因的检测与鉴定：目的基因在受体细胞中能否稳定存在，能否表达能否稳定存在，能否表达?1分子程度的鉴定：分子程度的鉴定：检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA上能否插入目的基上能否插入目的基因因-目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键；目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键；检测方法？检测方法？检测目的基因能否转录出了检测目的基因能否转录出了mRNA 检测方法？检测方法？检测目的基因能否翻译出了蛋白质检测目的基因能否翻译出了蛋白质 检测方法？检测方法？2个体生物学程度的鉴定个体生物学程度的鉴定 方法？方法？核酸探针

2、：核酸探针是指带核酸探针：核酸探针是指带有放射性同位素如有放射性同位素如32P、荧光分子等标志的特定序列荧光分子等标志的特定序列的核酸片段，它能和与其互的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，构成双补的核酸序列杂交，构成双链，所以可用于待测核酸样链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。品中特定基因序列的检测。包括包括DNA探针和探针和RNA探针。探针。 核酸探针具有特异性，高度核酸探针具有特异性，高度的敏感性。的敏感性。核酸分子杂交：互补的核苷核酸分子杂交：互补的核苷酸序列经过碱基配对构成稳酸序列经过碱基配对构成稳定的杂合双链分子的过程称定的杂合双链分子的过程称为核酸分子杂交。为核酸

3、分子杂交。完完把某终身物体内全部基因分别点到把某终身物体内全部基因分别点到DNA微列阵或者微列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的基因芯片上，再用不同发育阶段的cDNA与之杂交，与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的表达情况。就能了解某些基因对特定生长发育阶段的表达情况。 1斑点印迹斑点印迹Dot-blot将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸结实结合在膜上，通常还将点样后的膜进展称之为斑点印迹。为使核酸结实结合在膜上，通常还将点样后的膜进展80真空烘烤真空烘烤2h。 2Southern印迹印迹Southern blot这是指将

4、这是指将DNA片段经琼脂糖凝片段经琼脂糖凝胶电泳分别后转移到固相支持物上的过程。胶电泳分别后转移到固相支持物上的过程。 3 Northern印迹印迹Northern blotNorthern印迹是指将印迹是指将RNA片段片段变性及电泳分别后，转移到固相支持物上的过程。变性及电泳分别后，转移到固相支持物上的过程。 杂交的双方是所运用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基杂交的双方是所运用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组因组DNA,也可以是细胞总也可以是细胞总DNA或总或总RNA。根据运用的方法被检测的核酸。根据运用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交可以是

5、提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。探针必需经过标即细胞原位杂交。探针必需经过标志，以便示踪和检测。运用最普遍的探针标志物是同位素志，以便示踪和检测。运用最普遍的探针标志物是同位素, 但由于同位素但由于同位素的平安性，近年来开展了许多非同位素标志探针的方法的平安性，近年来开展了许多非同位素标志探针的方法,例如，运用荧光例如，运用荧光分子。分子。固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个根本过程：第一，固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个根本过程：第一，经过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标志探针与支经过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标志

6、探针与支持物上的核酸片段进展杂交；第三，杂交信号的检测。持物上的核酸片段进展杂交；第三，杂交信号的检测。 用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进展检测的方法称之为核酸原用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进展检测的方法称之为核酸原位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞替代纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进的细胞替代纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特

7、异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进展原位杂交，以确定有性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进展原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床运用上有独特的意义。量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床运用上有独特的意义。 2.杂交反响的根本过程杂交反响包括预杂交、杂交和漂洗几步操作。杂交反响的根本过程杂交反响包括预杂交、杂交和漂洗几步操作。 预杂交的目的是用非特异性预杂交的目的是用非特异性DNA分子鲑精分子鲑精DNA或小牛胸腺或小牛胸腺DNA及其它高分子

8、化合物及其它高分子化合物Denharts溶液将待测核酸分子中的非特异溶液将待测核酸分子中的非特异性位点封锁，以防止这些位点与探针的非特异性结合。杂交反响是使单性位点封锁，以防止这些位点与探针的非特异性结合。杂交反响是使单链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在一定温度和条件下进展复性链核酸探针与固定在膜上的待测核酸单链在一定温度和条件下进展复性反响的过程。杂交反响终了后，应进展洗膜处置以洗去非特异性杂交以反响的过程。杂交反响终了后，应进展洗膜处置以洗去非特异性杂交以及未杂交的标志探针，以防止干扰特异性杂交信号的检测。膜洗净后及未杂交的标志探针，以防止干扰特异性杂交信号的检测。膜洗净后,将继续进展杂交信号的检测。将继续进展杂交信号的检测。 基因芯片gene chip的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即经过与一组序列的核酸探针杂交进展核酸序列测定的方法，