紫外分光光度法

1、第一章第一章 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 -Ultravioletvisible spectroscopy，UV-Vis华南师范大学生命科学学院华南师范大学生命科学学院 范瑞芳范瑞芳 有机化合物的紫外有机化合物的紫外可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三种）种）：电子、电子、电子、电子、n电子电子。 分子轨道理论分子轨道理论：一个成键轨道必定一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。道或非键轨道上。 外层电子

2、吸收紫外或可见辐射后，就从外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态基态向向激发态（反键轨道激发态（反键轨道) )跃迁跃迁。主要有四种跃迁所需能量主要有四种跃迁所需能量大小顺序为大小顺序为：n n n n 第一节第一节 紫外紫外可见吸收光谱的基本概念与原理可见吸收光谱的基本概念与原理一、紫外一、紫外-可见吸收光谱的基本原理可见吸收光谱的基本原理跃迁跃迁 所需能量最大，所需能量最大，电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长吸收波长200nm。这类跃迁在跃迁选律上属于禁阻这类跃迁在

3、跃迁选律上属于禁阻跃迁，跃迁，摩尔吸光系数一般为摩尔吸光系数一般为10100 Lmol-1 cm-1，吸收谱带强度较弱。分吸收谱带强度较弱。分子中孤对电子和子中孤对电子和键同时存在时发生键同时存在时发生n 跃迁。丙酮跃迁。丙酮n 跃迁的跃迁的为为275nm, max为为22 Lmol-1 cm -1（溶剂环己烷溶剂环己烷)。二、生色团与助色团二、生色团与助色团生色团：生色团： 最有用的紫外最有用的紫外可见光谱是由可见光谱是由和和n跃迁跃迁产生的产生的。这两种跃这两种跃迁均要求有机物分子中含有迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。不饱和基团。这类含有这类含有键的不饱和基团称为键的不饱和基团称为生色

4、团。生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基基、偶氮基NN、乙炔基、腈基乙炔基、腈基CN等。等。助色团：助色团： 有一些含有有一些含有n n电子的基团电子的基团(如如OH、OR、NH、NHR、X等等)，它们本身没有生色功能它们本身没有生色功能( (不能吸收不能吸收200nm200nm的光的光) )，但当它们与生色团相，但当它们与生色团相连时，就会发生连时，就会发生n n共轭作用，增强生色团的生色能力共轭作用，增强生色团的生色能力( (吸收波长向长吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加波方向移动，且吸收强度增加

5、) )，这样的基团称为，这样的基团称为助色团。助色团。由于取代基或溶剂的影响造成有机化合物结构的变化，使 吸收峰向长波方向移动的现象称为吸收峰“红移红移”。 能使有机化合物的max 向长波方向移动的基团（如助色团、生色团）称为向红基团。由于取代基或溶液的影响造成有机化合物结构的变化，使 吸收峰向短波方向移动的现象称为吸收峰“蓝移蓝移”。 能使有机化合物的max 向短波方向移动的基团（如-CH3，-O-CO-CH3等）称为向蓝基团。三、红移与三、红移与蓝移蓝移由于有机化合物的结构变化使吸收峰摩尔吸光系数增加的现象称为增色效应增色效应。由于有机化合物的结构变化使吸收峰的摩尔吸光系数减小的现象称为减

6、色效应减色效应。*跃迁跃迁可以发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子中，其最大摩尔吸光率很大，吸收峰随溶剂极性增加向长波方向移动，即产生红移红移。下表列出了一些常见生色团*跃迁的吸收特性。生色团生色团化合物化合物溶剂溶剂羰基羰基正己烷正己烷188900烯烯正庚烷正庚烷17713000炔炔正庚烷正庚烷17810000max/nmmaxH3CCCH3OC6H13CHCH2C5H11CCCH3另有一些基团，本身并不产生吸收峰，但与生色团共存于同一分子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为助色团助色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处的吸收带的最大吸收位置和强度就会

7、改变。化合物化合物取代基取代基苯苯254300氯苯氯苯264320溴苯溴苯262325苯酚苯酚2731780苯甲醚苯甲醚2722240max/nmmaxClBrOHOCH3OH当一个分子中含有两个或两个以上的生色团时，按相互间的位置可以分为共共轭轭和非共轭非共轭两种情况：非共轭时，各个生色团各自独立吸收，吸收带由各生色团的吸收带叠加吸收带叠加而成；共轭时，生色团原有的吸收峰会发生改变吸收峰会发生改变，可产生新的吸收峰。下表列出了一些有关共轭结构的化合物的吸收特性。化合物化合物共轭双键数共轭双键数11955000220010000221721000325425000325835000C H3C

8、HC H2C O O HH(CHCH)3HH2CCHCHCH2CH2CHCO O HCH2CH2max/nmmax四、常见有机化合物紫外吸收光谱四、常见有机化合物紫外吸收光谱 饱和烃饱和烃饱和单键碳氢化合物只有电子，因而只能产生 * 跃迁。由于电子最不易激发，需要吸收很大的能量，才能产生 * 跃迁，因而这类化合物在 200nm 以上无吸收。所以它们在紫外光谱分析中常用作溶剂使用中常用作溶剂使用，如：己烷、环己烷、庚烷等。当饱和单键碳氢化合物中的氢被氧、氮、卤素、硫等原子取代时，这类化合物既有电子，又有n 电子，可以实现 * 和 n * 跃迁，其吸收峰可以落在远紫外区和近紫外区。例如：甲 烷的吸

9、收峰在 125nm，而 碘甲烷的 * 跃迁为 150210nm，n * 跃迁为 259nm；氯甲烷相应为 154161nm 及 173nm。可见，烷烃和卤代烃的紫外吸收很小，它们的紫外吸收光谱直接用于分析这类化合物的价值不大。不过，饱和醇类化合物如甲醇、乙醇都由于在近紫外区无吸收，常被用作紫外光谱分析的溶剂。 不饱和脂肪烃不饱和脂肪烃 芳香化合物芳香化合物 杂环化合物杂环化合物五、影响紫外五、影响紫外-可见吸收光谱的因素可见吸收光谱的因素 物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，等）不同，吸收

10、光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。等都可能发生变化。1.温度温度 在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。2. 溶剂溶剂 注意如下几点：注意如下几点： （1）同一种物质由于使用的溶剂不同，得到的紫外）同一种物质由于使用的溶剂不同，得到的紫外可见吸收光谱的峰形和可见吸收光谱的峰形和最大吸收位置可能不一样，所以在测定物质的吸收光谱时，一定要注明所使最大吸收位置可能不一样，所以在测定物质的吸收光谱时，一定要注明所使用的溶剂用的溶剂（2）尽量选用低极性溶剂；）尽量选用低极性溶剂；（3）能很好地溶解被测物，并

11、且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；（4）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。3.pH值值图4 红茶样品与标样1（波长：196nm;流动相：乙腈 1%磷酸水溶液=5 95（体积比）a为标样1的色谱曲线b为红茶样品12的色谱曲线NHOONH2OH茶氨酸的分子式图a, b,c为不同浓度茶氨酸标样在在196nm下的色谱图。(茶氨酸标样用甲醇溶剂配制）。图d为甲醇在196nm下的色谱图。abcd第二节第二节 紫外吸收光谱的应用紫外吸收光谱的应用一、定性鉴定一、定性鉴定1.1 未知试样的定性鉴定未知

12、试样的定性鉴定将经提纯的样品和标准物用相同溶剂配成溶液，并在相同条件下绘制吸收光谱曲线，比较其吸收光谱是否一致。如果紫外光谱曲线完全相同（包括曲线形状、max、min，吸收峰数目、拐点及max 等）。则可初步认为是同一种化合物。为了进一步确认可更换一种溶剂重新测定后再作比较. 如果没有标准物，则 可借助各种有机化合物的紫外可见标准谱图及有关电子光谱的文献资料进行比较。最常用的谱图资料是萨特勒标准谱图及手册. 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。1.2 推

13、测化合物的分子结构推测化合物的分子结构1.3化合物纯度的检测化合物纯度的检测 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。 如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。 当A260/A280 2.0，表示RNA含量较高 当A260/A280=1.82.0，表示DNA较纯因为核酸中含有共轭的碱基，蛋白质中含有一些芳香族氨基酸（含有共轭双键），蛋白质与核酸的浓度在260 nm处与紫外吸收波长成正比，蛋白质在280nm处有吸收峰，有公式计算：DNA浓度（ng /L）=A26050稀释倍数 （1）待上样： （2）上样： （3）上样30min （4）上样60min（5）加洗脱液2

14、0min （6）加洗脱液40min（7）接取洗脱溶液 （8）洗脱完毕可见A618.5nm时出现峰值1.555，又由于A258.5nm和A310.5时出现峰值2.476和0.491，且两点间近似于直线关系，于是可得A280nm约等于1.655。最终A618.5/ A280=0.94。所得纯度与一般认可值4相比较低。取A620nm吸收最大一管在紫外可见光谱仪作200nm700nm扫描得到以下结果：二、朗伯二、朗伯-比尔定律比尔定律朗伯朗伯-比尔定律比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积的稀溶液时，溶液的吸光度与

15、吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比成正比，即，即 A= cl 式中比例常数式中比例常数与吸光物质的本性，入射光波长及温度等与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。因素有关。c为吸光物质浓度，为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。为透光液层厚度。 -朗伯朗伯-比尔定律是紫外比尔定律是紫外-可见分光光度法定量的理论基础可见分光光度法定量的理论基础三、吸光系数三、吸光系数当l以cm，c以g/L为单位，称为吸光系数，用 a表示。A= a cla的单位为L/(g.cm)朗伯朗伯比耳定律只适用于稀溶液。比耳定律只适用于稀溶液。四、偏离朗伯四、偏离朗伯-比耳定律的因素比耳定律的因素（1）入射光为非单色光）入

16、射光为非单色光 难以获得真正的纯单色光难以获得真正的纯单色光。 朗朗比耳定律的前提条件之一是入射光为比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯复合光可导致对朗伯比耳定律的正或负偏离。比耳定律的正或负偏离。 非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯对朗伯比耳定律的偏离，最主要的是非单色光比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。作为入射光引起的偏离。 为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大

17、吸收波长且吸收最大吸收波长且吸收曲线较平坦处曲线较平坦处。（2）溶液的不均性。）溶液的不均性。实际样品的混浊，加入的保护胶体，蒸馏水中的微生物，存在散射以及共振发射等，均可吸光质点的吸光特性变化大。（4）光程的不一致性。）光程的不一致性。光源不是点光源，比色皿光径长度不一致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均造成光径不一致，从而与定律偏离。测量前的化学预处理工作是十分重要的，如控制好显色反应条件，控制溶液的化学测量前的化学预处理工作是十分重要的，如控制好显色反应条件，控制溶液的化学平衡等，以防止产生偏离吸收定律。平衡等，以防止产生偏离吸收定律。（3）溶液的化学因素引起偏离）溶液的化学因素引起偏

18、离溶液中的吸光物质因离解、缔合，形成新的化合物而改变了吸光物质的浓度，导致偏离吸收定律；（5）比尔定律的局限性引起偏离）比尔定律的局限性引起偏离严格说，比尔定律是一个有限定律，它只适用于浓度小于0.01mol.L-1 的稀溶液。因为浓度高时，吸光粒子间平均距离减小，以致每个粒子都会影响其邻近粒子的电荷分布。这种相互作用使它们的摩尔吸光系数发生改变，因而导致偏离比尔定律。为此，在实际工作中，待测溶液的浓度应控制在待测溶液的浓度应控制在 0.01 molL-1 以下以下。pH=7.5的缓冲液定容至25mL在540nm处测定茶饮料5mL酒石酸亚铁5mL蒸馏水9mL显色液A1 底色液A2 空白对照 茶

19、多酚 分光光度法 茶叶中多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色络合物。用分光光度法测定其含量。 2526线性回归得：20.8270.0765,0.9989yxR故茶游离氨基酸在0.007mg0.341mg之间，线性关系良好 根据GB/T 8314-2002 茶 游离氨基酸总量，用茚三酮比色法检测茶饮料中游离氨基酸的含量。以茶氨酸标样的质量（mg）为横坐标，ABS值为纵坐标，绘制茶氨基酸标准曲线。 茚三酮比色法分析茶饮料中的游离氨基酸-氨基酸在pH8.0的条件下与茚三酮共热，形成紫色络合物，用分光光度法在特定的波长下测定其含量。第三节紫外第三节紫外-可见分光光度计可见分光光度计一、主要部件的性能与作用一、主要部件的性能与作用 基本结构基本结构:光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器信号显示系统信号显示系统 样