基因工程大肠杆菌克隆载体

1、基因工程大肠杆菌克隆载体所有克隆质粒中，最多的一类是以大肠杆菌所有克隆质粒中，最多的一类是以大肠杆菌为宿主的。为宿主的。因为：因为： 过去过去5050年内，这种细菌在基础研究中一直年内，这种细菌在基础研究中一直扮演着中心角色；扮演着中心角色； 已积累大量有关大肠杆菌的微生物学、生已积累大量有关大肠杆菌的微生物学、生物化学和遗传学知识；物化学和遗传学知识； 事实上所有关于基因结构和功能的基础研事实上所有关于基因结构和功能的基础研究都是以大肠杆菌为材料而开展的。究都是以大肠杆菌为材料而开展的。第1页/共87页3.1 3.1 基于大肠杆菌质粒的克隆载体基于大肠杆菌质粒的克隆载体基因克隆领域最得到广泛

2、应用的也是最简单基因克隆领域最得到广泛应用的也是最简单的，是那些以大肠杆菌质粒为基础而构建的的，是那些以大肠杆菌质粒为基础而构建的克隆载体。克隆载体。可用于大肠杆菌的有很多不同的质粒载体，可用于大肠杆菌的有很多不同的质粒载体，其中有很大一部分是由商业公司提供的。他其中有很大一部分是由商业公司提供的。他们开发的载体既易于纯化，又结合一些想要们开发的载体既易于纯化，又结合一些想要的特性，如高的转化效率、方便的转化和重的特性，如高的转化效率、方便的转化和重组的筛选标志以及克隆相当大的组的筛选标志以及克隆相当大的DNADNA片段片段( (高高达达8kb)8kb)的能力。的能力。如：如：pBR322pB

3、R322。pBR322pBR322是最早被构建的质粒，是最早被构建的质粒，至今仍被广泛使用。至今仍被广泛使用。第2页/共87页3.1.1 3.1.1 质粒克隆载体的命名法质粒克隆载体的命名法“pBR322pBR322”这个名字符合载体命名法的标准规则：这个名字符合载体命名法的标准规则： “p p”说明它是一个质粒；说明它是一个质粒； “BRBR表示最初构建它的实验室表示最初构建它的实验室(BR(BR代表了两个构建人的名字：代表了两个构建人的名字：BolivarBolivar和和Rodriguez)Rodriguez)。 “322322把该质粒和该实验室构建的其他质粒区分开来把该质粒和该实验室构

4、建的其他质粒区分开来( (另外还另外还有有pBR325pBR325，pBR327pBR327，pBR328pBR328第3页/共87页3.1.2 pBR3223.1.2 pBR322的一些有用特性的一些有用特性从从pBR322pBR322的遗传图谱和物理图谱的遗传图谱和物理图谱( (图图6-1)6-1)可可以看出为什么它能是一个如此受欢迎的克隆以看出为什么它能是一个如此受欢迎的克隆载体？载体？第一个优点在于它的大小第一个优点在于它的大小 第第2 2章里提到，作为一个克隆载体它的大小章里提到，作为一个克隆载体它的大小应该小于应该小于10kb10kb，否则在提纯它的时候很容易，否则在提纯它的时候很

5、容易导致导致DNADNA断裂。断裂。 pBR322pBR322只有只有4 363bp4 363bp，意味着可以很容易，意味着可以很容易纯化质粒本身及其所携带的重组纯化质粒本身及其所携带的重组DNADNA分子。分子。即使添加上即使添加上6kb6kb的的DNADNA链，重组的链，重组的pBR322pBR322的的大小仍在可操作的范围内。大小仍在可操作的范围内。第4页/共87页第5页/共87页第二个优点是拥有两套抗生素耐药性基因两个耐药性基因两个耐药性基因( (氨苄青霉素耐药性和四环素氨苄青霉素耐药性和四环素耐药性基因耐药性基因) )都可作为含有该质粒的筛选标都可作为含有该质粒的筛选标志，而且志，而

6、且每个抗性基因内都拥有一个限制性每个抗性基因内都拥有一个限制性单酶切位点单酶切位点，这在克隆实验中非常有用。，这在克隆实验中非常有用。用用PstPstI I，PuvPuvI I或或ScaScaI I酶切后插入酶切后插入DNADNA会导致会导致氨苄青霉素抗性基因失活；用氨苄青霉素抗性基因失活；用BamBamHIHI及及HinHindd等等8 8个限制性内切核酸酶酶切后插入个限制性内切核酸酶酶切后插入DNADNA会导致四环素抗性基因失活。会导致四环素抗性基因失活。这意味着这意味着pBR322pBR322支持很多种不同黏性末端的支持很多种不同黏性末端的DNADNA片段的导入。片段的导入。第6页/共8

7、7页第三个优点在于第三个优点在于pBR322pBR322有相当高的拷贝数有相当高的拷贝数 通常在被转化过的大肠杆菌中有大约通常在被转化过的大肠杆菌中有大约1515个个pBR322pBR322质粒分子；质粒分子； 在蛋白质合成抑制剂在蛋白质合成抑制剂( (如氯霉素如氯霉素) )的存在的存在下，通过质粒扩增，拷贝数可以增加到下，通过质粒扩增，拷贝数可以增加到1 1 000-3 000000-3 000。 这样，通过培养大肠杆菌就可以获得大这样，通过培养大肠杆菌就可以获得大量重组过的量重组过的pBR322pBR322质粒分子。质粒分子。第7页/共87页3.1.3 pBR3223.1.3 pBR322

8、的家谱的家谱pBR322pBR322作为一个克隆载体的方便性决非偶然，作为一个克隆载体的方便性决非偶然，它在被设计时就定好了要拥有这些特点。它在被设计时就定好了要拥有这些特点。构建构建pBR322pBR322的步骤简述如图。的步骤简述如图。它的构建是一件曲折而艰巨的操作，用到了它的构建是一件曲折而艰巨的操作，用到了全部巧妙的基因操作技术。全部巧妙的基因操作技术。pBR322pBR322实际上由实际上由3 3个在自然界存在的天然质粒个在自然界存在的天然质粒拼接而成。拼接而成。第8页/共87页第9页/共87页3.1.4 3.1.4 其他大肠杆菌质粒克隆载其他大肠杆菌质粒克隆载体体pBR322pBR

9、322质粒是在质粒是在2020世纪世纪7070年代后期被构建出来的，第一份描述它年代后期被构建出来的，第一份描述它的用途的论文在的用途的论文在19771977发表。发表。从那以后，人们构建了大量其他的质粒克隆载体，它们大多数只从那以后，人们构建了大量其他的质粒克隆载体，它们大多数只是对是对pBR322pBR322作了少量修改。作了少量修改。第10页/共87页pBR327pBR327一个高拷贝数质粒一个高拷贝数质粒pBR327pBR327通过从通过从pBR322pBR322中移除一个长中移除一个长1 089bp1 089bp的片段而构建。片段的删除并没有损伤的片段而构建。片段的删除并没有损伤am

10、pampR R和和terterR R这两个抗性基因，但改变了质粒的复这两个抗性基因，但改变了质粒的复制能力和接合能力。制能力和接合能力。pBR327pBR327与与pBR322pBR322有两点重要的不同有两点重要的不同 (1)pBR327(1)pBR327的拷贝数比的拷贝数比pBR322pBR322更高更高。每个大肠杆菌中可以存在每个大肠杆菌中可以存在30-4530-45个质粒分子。个质粒分子。当实验的目标是研究被克隆的基因功能的时当实验的目标是研究被克隆的基因功能的时候，有更高拷贝数的候，有更高拷贝数的pBR327pBR327就更适合于用就更适合于用作载体。作载体。拷贝数越高，被克隆的基因

11、在细胞中所产生拷贝数越高，被克隆的基因在细胞中所产生的效果就越容易被发现。的效果就越容易被发现。第11页/共87页(2)1 089bp(2)1 089bp片段的删除，破坏了片段的删除，破坏了pBR322pBR322的接的接合能力，使合能力，使pBR327pBR327不能把自己转移到另外不能把自己转移到另外一个大肠杆菌细胞中去一个大肠杆菌细胞中去。这一点对生物防范很重要，避免了粗心的生这一点对生物防范很重要，避免了粗心的生物学家使重组后的质粒从试管和细菌植株中物学家使重组后的质粒从试管和细菌植株中逸出。逸出。相反，相反，pBR322pBR322在理论上可以通过结合而进入在理论上可以通过结合而进入

12、天然的大肠杆菌细胞中去，虽然事实上天然的大肠杆菌细胞中去，虽然事实上pBR322pBR322也有一定的安全措施减少这种情况也有一定的安全措施减少这种情况的发生。的发生。当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先当被克隆的基因有潜在的危害性时，应优先选择选择pBR327pBR327。第12页/共87页第13页/共87页pUC8pUC8乳糖选择质粒乳糖选择质粒pUC8pUC8也是一个源自于也是一个源自于pBR322pBR322的质粒，的质粒，只保留了只保留了pBR322pBR322的复制起点和的复制起点和ampampR R基因。基因。ampampR R基因的核酸序列也被改变了，不再包含基因的核酸序列也

13、被改变了，不再包含唯一的限制性酶切位点。唯一的限制性酶切位点。所有这些位点被集中到所有这些位点被集中到pUC8pUC8所携带的所携带的lacZlacZ 基因中的一小段序列上。基因中的一小段序列上。 pUC8pUC8所拥有的所拥有的3 3个优点使它成为最受欢迎的大个优点使它成为最受欢迎的大肠杆菌克隆载体之一。肠杆菌克隆载体之一。第14页/共87页第15页/共87页第一个优点第一个优点人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上产生了一个偶然的突变，使得它在大肠杆菌产生了一个偶然的突变，使得它在大肠杆菌内的拷贝数达到了内的拷贝数达到了500-700500-700（扩

14、增以前的数（扩增以前的数目）。目）。这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量的目的量的目的DNADNA。第二个优点第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅在于重组体的识别只需一步，仅仅只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄仅只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青霉素和青霉素和X-galX-gal的琼脂培养基上。的琼脂培养基上。而而pBR322pBR322和和pBR327pBR327，重组体的筛选都需要把，重组体的筛选都需要把菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种菌落从一种抗生素培养基原样转移到另一种抗生素培养基平板。抗生素培养基平板。一个用一个用pUC8pUC

15、8做载体的克隆实验比选择做载体的克隆实验比选择pBR322pBR322和和pBR327pBR327要节约一半的时间。要节约一半的时间。第16页/共87页第三个优点第三个优点是是pUC8pUC8拥有拥有多克隆单酶切位点多克隆单酶切位点，这使有两个不同黏性末端的这使有两个不同黏性末端的DNADNA片段片段( (比如一比如一端是被端是被EcoEcoRIRI酶切过的，另一端是被酶切过的，另一端是被BamBamHIHI酶切过的酶切过的) )可以直接被克隆，而不需求助于可以直接被克隆，而不需求助于加入连接片段的操作。加入连接片段的操作。其他的其他的pUCpUC载体，载体，拥有不同的限制性酶切位点，拥有不同

16、的限制性酶切位点，具有更大的灵活性，允许更多种不同的具有更大的灵活性，允许更多种不同的DNADNA片段被克隆。片段被克隆。此外，这些载体中的限制性酶切位点与存在此外，这些载体中的限制性酶切位点与存在于于M13mp M13mp 系列载体中的限制性酶切位点一系列载体中的限制性酶切位点一样，可以很方便的进行样，可以很方便的进行DNADNA测序或体外诱变。测序或体外诱变。第17页/共87页第18页/共87页pGEM3ZpGEM3Z克隆克隆DNADNA的体外转录的体外转录pGEM3ZpGEM3Z与与pUCpUC载体很相似：都含有载体很相似：都含有ampampR R和和lacZlacZ基因，在后者上有一个

17、限制性酶切位基因，在后者上有一个限制性酶切位点，而且两个质粒有着差不多完全相同的大点，而且两个质粒有着差不多完全相同的大小。小。区别：区别：pGEM3ZpGEM3Z多两个短片段，每一个片段都多两个短片段，每一个片段都可以充当启动子，黏附可以充当启动子，黏附RNARNA聚合酶。聚合酶。外源外源DNADNA在限制性酶切位点被导入在限制性酶切位点被导入pGEM3ZpGEM3Z载载体，在限制性酶切位点的两边分别存在着这体，在限制性酶切位点的两边分别存在着这两个启动子序列。这就意味着，在试管里同两个启动子序列。这就意味着，在试管里同时放入重组后的时放入重组后的pGEM3ZpGEM3Z质粒和提纯的质粒和提

18、纯的RNARNA聚聚合酶，被克隆的合酶，被克隆的DNADNA分子会指导合成相应的分子会指导合成相应的RNARNA，发生转录。产生的，发生转录。产生的RNARNA可用作杂交探可用作杂交探针，也可用于研究针，也可用于研究RNARNA加工加工 ( (如内含子如何如内含子如何切除切除) )，或是用于合成蛋白质。，或是用于合成蛋白质。第19页/共87页第20页/共87页被被pGEM3ZpGEM3Z和其他同类载体所携带的启动子并和其他同类载体所携带的启动子并不是被大肠杆菌不是被大肠杆菌RNARNA聚合酶识别的标准启动聚合酶识别的标准启动子。子。实际上这些启动子有的被实际上这些启动子有的被T7T7噬菌体编码

19、的噬菌体编码的RNARNA聚合酶专一性识别，有的被聚合酶专一性识别，有的被SP6SP6噬菌体编码噬菌体编码的的RNARNA聚合酶专一性识别。聚合酶专一性识别。当大肠杆菌被其中某种噬菌体侵染时就合成当大肠杆菌被其中某种噬菌体侵染时就合成这些这些RNARNA聚合酶，用以转录噬菌体基因。聚合酶，用以转录噬菌体基因。之所以在体外转录系统中选择病毒之所以在体外转录系统中选择病毒RNARNA聚合酶，聚合酶，是因为它们有着相当高的酶活，因此噬菌体是因为它们有着相当高的酶活，因此噬菌体基因一定能够很快被转录出来，能够在每分基因一定能够很快被转录出来，能够在每分钟合成钟合成1-21-2g gRNARNA，比标准

20、的大肠杆菌，比标准的大肠杆菌RNARNA聚聚合酶高效得多。合酶高效得多。第21页/共87页3.2 3.2 基于基于M3M3噬菌体的克隆载体噬菌体的克隆载体对任何克隆载体而言，最基本的要求是能够对任何克隆载体而言，最基本的要求是能够在宿主细胞内自我复制。在宿主细胞内自我复制。质粒载体很容易满足这个要求质粒载体很容易满足这个要求首先它有一个短的首先它有一个短的DNADNA序列能够充当复制起点，序列能够充当复制起点，并且它复制所需要的酶也可以全部或大部分并且它复制所需要的酶也可以全部或大部分从宿主细胞获得。从宿主细胞获得。精密的构建操作，使最终形成的质粒载体如精密的构建操作，使最终形成的质粒载体如p

21、BR322pBR322成为一个完整而具备功能的复制子。成为一个完整而具备功能的复制子。第22页/共87页噬菌体，如噬菌体，如M13M13的复制情况的复制情况就较为复杂。就较为复杂。噬菌体的噬菌体的DNADNA分子通常带有几个为复制所必需分子通常带有几个为复制所必需的基因，包括编码噬菌体蛋白外壳的组分的的基因，包括编码噬菌体蛋白外壳的组分的基因和编码噬菌体特有的复制酶的基因。基因和编码噬菌体特有的复制酶的基因。改变或是删除这些必需基因中的任一个，都改变或是删除这些必需基因中的任一个，都会损伤或是毁坏噬菌体的复制能力。会损伤或是毁坏噬菌体的复制能力。因此可供改变噬菌体因此可供改变噬菌体DNADNA

22、分子的自由度很小，分子的自由度很小，而而通常的噬菌体载体与原始分子的差别很小通常的噬菌体载体与原始分子的差别很小。第23页/共87页以以M13M13噬菌体为例，可以看出构建噬菌体克隆噬菌体为例，可以看出构建噬菌体克隆载体的难度。载体的难度。一个正常的一个正常的M13M13噬菌体的基因组是噬菌体的基因组是6.4kb6.4kb，为，为紧紧挤在一起的紧紧挤在一起的1010个基因所占据，每一个基个基因所占据，每一个基因对噬菌体的复制都是必需的。在基因间只因对噬菌体的复制都是必需的。在基因间只有一个仅长有一个仅长507bp507bp的短序列，新的的短序列，新的DNADNA必须必须从这里插入才不会损伤其他

23、基因，还必须保从这里插入才不会损伤其他基因，还必须保证同样处在这个短序列中的复制起点不被破证同样处在这个短序列中的复制起点不被破坏。坏。所以，只有一个很小的空间用于改造所以，只有一个很小的空间用于改造M13M13噬菌噬菌体。体。然而，然而，M13M13有一个很吸引人的优点：它使人们有一个很吸引人的优点：它使人们可以获得单链的被克隆可以获得单链的被克隆DNADNA。第24页/共87页第25页/共87页第26页/共87页3.2.1 M13mp23.2.1 M13mp2克隆载体的开发克隆载体的开发构建构建M13M13克隆载体第一步，是把克隆载体第一步，是把lacZlacZ 基因导基因导入到噬菌体入到

24、噬菌体M13M13的短序列中。产生了的短序列中。产生了M13mplM13mpl，它在含有它在含有X-galX-gal的琼脂板上形成蓝色的噬菌的琼脂板上形成蓝色的噬菌斑。斑。M13mplM13mpl的的lacZlacZ 基因上不含有任何的限制性基因上不含有任何的限制性酶切位点，但在靠近基因起始位置的地方有酶切位点，但在靠近基因起始位置的地方有一个一个GGATTCGGATTC的序列。改变一个核苷酸就变的序列。改变一个核苷酸就变成成GAATTCGAATTC，这是，这是EcoEcoRIRI的识别位点。这个改的识别位点。这个改变是用体外诱变完成的，产生了变是用体外诱变完成的，产生了M13mp2M13mp

25、2克克隆载体。隆载体。第27页/共87页M13mp2M13mp2有一个稍稍改变的有一个稍稍改变的lacZlacZ 基因基因( (第六个第六个密码子编码天冬氨酰而不是天冬氨酸密码子编码天冬氨酰而不是天冬氨酸) )，但，但转染了转染了M13mp2M13mp2的细胞产生的的细胞产生的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶仍然有着正常的功能。仍然有着正常的功能。 M13mp2M13mp2是最简单的是最简单的M13M13克隆载体克隆载体。有。有EcoEcoRIRI黏黏性末端的性末端的DNADNA片段可以插入进克隆位点，重片段可以插入进克隆位点，重组体可以通过在组体可以通过在X-galX-gal培养基上的噬菌斑得培养基上

26、的噬菌斑得到识别。到识别。第28页/共87页第29页/共87页3.2.2 M13mp73.2.2 M13mp7对称的克隆位点对称的克隆位点开发开发M13M13克隆载体的下一步是在克隆载体的下一步是在lacZlacZ 基因上基因上添加额外的酶切位点。添加额外的酶切位点。通过在试管中合成一个叫做多接头通过在试管中合成一个叫做多接头(polylinker)的寡核苷酸而实现。的寡核苷酸而实现。多接头包含一系列的限制性酶切位点，有一多接头包含一系列的限制性酶切位点，有一个个EcoEcoRIRI的黏性末端。的黏性末端。多接头被插入到多接头被插入到M13mp2M13mp2克隆载体的克隆载体的EcoEcoRI

27、RI位位点上，形成了一个更加复杂的载体，即点上，形成了一个更加复杂的载体，即M13mp7M13mp7。 第30页/共87页M13mp7M13mp7有有4 4个可能的克隆位点：个可能的克隆位点： EcoEcoRIRI，BamBamHIHI，SalSalI I和和PstPstI I。为了不完全破坏掉为了不完全破坏掉lacZlacZ基因，在设计这个多基因，在设计这个多接头时，人们使得读码框在通过多接头后没接头时，人们使得读码框在通过多接头后没发生改变。发生改变。这样，产生的这样，产生的-半乳糖苷酶虽然被改变了序半乳糖苷酶虽然被改变了序列，但仍然有着正常的功能。列，但仍然有着正常的功能。 第31页/共

28、87页第32页/共87页用用EcoEcoRIRI，BamBamHIHI，SalSalI I中的任意一种去酶解中的任意一种去酶解M13mp7M13mp7，整个多接头或其一部分会被切掉。，整个多接头或其一部分会被切掉。在其他在其他DNADNA存在下，有存在下，有3 3种连接可能发生：种连接可能发生： (1)(1)插入的新插入的新DNADNA， (2)(2)插入的多接头。插入的多接头。 (3)(3)载体自连。载体自连。第33页/共87页新新DNADNA的插入会阻碍的插入会阻碍-半乳糖苷酶的产生，半乳糖苷酶的产生，因此重组体在含因此重组体在含X-galX-gal的琼脂培养基上产生的琼脂培养基上产生无色

29、透明的噬菌斑。无色透明的噬菌斑。当插入的片段是多接头时，原来的当插入的片段是多接头时，原来的M13mp7M13mp7载载体又再次形成了，噬茵斑是蓝色的。体又再次形成了，噬茵斑是蓝色的。如果是载体自连，噬菌斑应该是什么颜色如果是载体自连，噬菌斑应该是什么颜色? ? 多接头又一次显示其巧妙设计：不管用哪多接头又一次显示其巧妙设计：不管用哪一个内切酶酶解，自连的载体都会连成有功一个内切酶酶解，自连的载体都会连成有功能的能的lacZlacZ 基因，最终形成蓝色的噬菌斑。基因，最终形成蓝色的噬菌斑。因此因此，只有重组体产生无色透明的噬茵斑。只有重组体产生无色透明的噬茵斑。第34页/共87页第35页/共8

30、7页由于携带对称的克隆位点，无论新的由于携带对称的克隆位点，无论新的DNADNA是通过是通过BamBamHIHI，SalSalI I或或PstPstI I中的哪一个酶中的哪一个酶切位点插入载体，都可以用切位点插入载体，都可以用EcoEcoRIRI从重组从重组后的分子中切除。后的分子中切除。第36页/共87页第37页/共87页3.2.3 3.2.3 更复杂的更复杂的M13M13载体载体越精巧的越精巧的M13M13载体有更复杂的多接头被插入到载体有更复杂的多接头被插入到lacZlacZ 基因中。基因中。M13mp8M13mp8：它是它是pUC8pUC8的对应物。和的对应物。和pUC8pUC8一样，

31、一样，它允许插入有不同的两个黏性末端的它允许插入有不同的两个黏性末端的DNADNA片片段。段。M13mp8M13mp8姐妹载体姐妹载体M13mp9M13mp9有一个相同的多接头，有一个相同的多接头，但是多接头的方向相反，这使得它有另外一但是多接头的方向相反，这使得它有另外一个优点。当把一个个优点。当把一个DNADNA片段克隆进片段克隆进M13mp8M13mp8后，后，可以用两种限制性内切酶把它再切下来，然可以用两种限制性内切酶把它再切下来，然后把它连入后把它连入M13mp9M13mp9，那么这片段在载体中，那么这片段在载体中就有了相反的方向。就有了相反的方向。第38页/共87页这个特点在这个特

32、点在DNADNA测序中很重要，因为核苷酸序测序中很重要，因为核苷酸序列从多接头的末端一直读进插入的列从多接头的末端一直读进插入的DNADNA片段。片段。通常通常从测序实验中只能读出约从测序实验中只能读出约600600个碱基个碱基，如，如果插入的果插入的DNADNA超过这个长度，就有一个末端超过这个长度，就有一个末端的序列读不出来。的序列读不出来。一种解决的方法就是一种解决的方法就是把把DNADNA换个方向，再插入换个方向，再插入到姐妹载体中到姐妹载体中。用这个新得到的克隆，测序。用这个新得到的克隆，测序实验就可以得到另一端的序列。实验就可以得到另一端的序列。第39页/共87页第40页/共87页

33、还有其他的还有其他的M13M13载体可成对选择使用。载体可成对选择使用。与与M13mp8/9M13mp8/9很相似的有：很相似的有： M13mplO/11M13mplO/11； M13mpl8/19M13mpl8/19；但是它们有不同的多接头，即，有不同的限但是它们有不同的多接头，即，有不同的限制性酶切位点。制性酶切位点。第41页/共87页3.2.4 M133.2.4 M13和质粒的杂交载体和质粒的杂交载体尽管尽管M13M13可以产生单链可以产生单链DNADNA，这使它显得非常，这使它显得非常有用，但它有很大一个缺点。有用，但它有很大一个缺点。用用M13M13作载体时，可以容纳的作载体时，可以

34、容纳的DNADNA片段大小非片段大小非常有限，通常认为常有限，通常认为100bp100bp是上限，特殊情况是上限，特殊情况下克隆的片段长度可达下克隆的片段长度可达1kb1kb。为了解决这个问题，人们把为了解决这个问题，人们把M13M13基因组的一部基因组的一部分和质粒分和质粒DNADNA结合在一起，构建了一种新型结合在一起，构建了一种新型的载体，叫做噬菌体质粒的载体，叫做噬菌体质粒(plagemids)。第42页/共87页pEMBL8pEMBL8是一个噬菌体质粒是一个噬菌体质粒：通过把通过把M13M13基因组中一个基因组中一个1 300bp1 300bp的片段导入的片段导入pUC8pUC8中而

35、构建。中而构建。M13M13在形成被分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使在形成被分泌的噬菌体颗粒前有一种酶使双链双链DNADNA变成单链变成单链DNADNA，而被导入的那一段，而被导入的那一段M13 DNAM13 DNA则含有被这种酶识别的信号序列。则含有被这种酶识别的信号序列。虽然这段序列从虽然这段序列从M13M13的基因组中被分离出来，的基因组中被分离出来，但功能仍然还在。但功能仍然还在。所以，所以，pEMBL8pEMBL8也可以被转化成单链的也可以被转化成单链的DNADNA，并能以有缺陷的噬菌体颗粒的形式被分泌出并能以有缺陷的噬菌体颗粒的形式被分泌出来。用作来。用作pEMBL8pEMBL8克隆实

36、验的宿主大肠杆菌克隆实验的宿主大肠杆菌必须随后被正常的必须随后被正常的M13M13噬菌体感染。正常的噬菌体感染。正常的M13M13噬菌体是作为噬菌体是作为辅助噬菌体辅助噬菌体(helper phage)，提供必要的复制酶和蛋白质外壳。，提供必要的复制酶和蛋白质外壳。第43页/共87页pEMBL8pEMBL8由于是从由于是从pUC8pUC8发展来的，同样也有插发展来的，同样也有插入多接头的入多接头的lacZlacZ基因，重组体可以通过在基因，重组体可以通过在含有含有X-galX-gal的培养基上的噬菌斑而被鉴定出的培养基上的噬菌斑而被鉴定出来。来。可以用可以用pEMBL8pEMBL8产生长度达到

37、产生长度达到10kb10kb的单链的单链DNADNA片段，这极大地扩展了片段，这极大地扩展了M13M13克隆系统的使用克隆系统的使用范范围。第44页/共87页第45页/共87页3.3 基于基于噬菌体的克隆载体噬菌体的克隆载体基于基于噬菌体构建克隆载体时，必须解决两噬菌体构建克隆载体时，必须解决两个难题：个难题：(1)(1)噬菌体的噬菌体的DNADNA分子仅能再增加分子仅能再增加5 5，即，即新新增加的增加的DNADNA长度不能超过长度不能超过3kb3kb。一旦。一旦DNADNA的总的总长超过了长超过了52kb52kb，不能包装进入噬菌体的头部，不能包装进入噬菌体的头部，也就不能形成感染性的病毒

38、颗粒。这严重制也就不能形成感染性的病毒颗粒。这严重制约了插入约了插入DNADNA片段的长度，限制了片段的长度，限制了噬菌体噬菌体载体的使用。载体的使用。(2)(2)噬菌体基因组很大，对于几乎每一种限噬菌体基因组很大，对于几乎每一种限制性制性内切酶识别位点都不是单一的内切酶识别位点都不是单一的。所以，。所以，无法按我们的需要去酶切和按顺序重新装成无法按我们的需要去酶切和按顺序重新装成有功能的基因组。有功能的基因组。第46页/共87页第47页/共87页3.3.1 3.3.1 从从噬菌体基因组移除部分片噬菌体基因组移除部分片段而不损伤其生存能力段而不损伤其生存能力发现：一个大的发现：一个大的DNAD

39、NA片段可以删除。片段可以删除。该片段位于该片段位于DNADNA的中部，删除后并不影响噬的中部，删除后并不影响噬菌体侵染大肠杆菌的能力。菌体侵染大肠杆菌的能力。去掉这个非必需片段，可以减小去掉这个非必需片段，可以减小15kb15kb。即，。即，可以在噬菌体包装前加入可以在噬菌体包装前加入18kb18kb的外源的外源DNADNA。这一段非必需片段实际上包含一些基因，它这一段非必需片段实际上包含一些基因，它们和们和噬菌体整合与脱离大肠杆菌染色体相噬菌体整合与脱离大肠杆菌染色体相关。关。删除掉这一部分，删除掉这一部分，噬菌体成为一个非溶源噬菌体成为一个非溶源性的噬菌体，进行裂解循环。这样无需诱导性的

40、噬菌体，进行裂解循环。这样无需诱导就可以形成噬菌斑，这对于一个克隆载体来就可以形成噬菌斑，这对于一个克隆载体来说本身就是一个理想的特点。说本身就是一个理想的特点。第48页/共87页第49页/共87页3.3.2 用自然选择来筛选那些缺少酶用自然选择来筛选那些缺少酶切位点的切位点的噬菌体噬菌体即使从即使从噬菌体基因组中移掉那个大片段，噬菌体基因组中移掉那个大片段，对于大多数内切酶来说还是有太多的识别位对于大多数内切酶来说还是有太多的识别位点。点。如果仅仅要移除一两个这样的识别位点，我如果仅仅要移除一两个这样的识别位点，我们可以通过体外突变来解决。们可以通过体外突变来解决。例如，想要去掉一个例如，想

41、要去掉一个EcoEcoRIRI的位点的位点GAATTCGAATTC，可以把它突变成可以把它突变成GGATTCGGATTC，不会被，不会被EcoEcoRIRI切开。切开。但是，即使现在，要想改变一个但是，即使现在，要想改变一个DNADNA分子上的分子上的好几个位点，体外突变仍不是一个有效方法。好几个位点，体外突变仍不是一个有效方法。第50页/共87页实际上，可以用自然选择来选出那些缺少不实际上，可以用自然选择来选出那些缺少不需要的酶切位点的需要的酶切位点的噬菌体。噬菌体。选用可以产生选用可以产生EcoEcoRIRI的大肠杆菌做寄主，这样的大肠杆菌做寄主，这样大多数的噬菌体大多数的噬菌体DNADN

42、A就被酶解掉了，但有少就被酶解掉了，但有少量的幸存者并产生了噬菌斑。量的幸存者并产生了噬菌斑。这些突变这些突变噬菌体缺少一个或者好几个噬菌体缺少一个或者好几个EcoEcoRIRI识别位点。识别位点。几个这样的感染循环过后，得到的几个这样的感染循环过后，得到的噬菌体噬菌体是缺失全部或大多数是缺失全部或大多数EcoEcoRIRI位点的突变体。位点的突变体。第51页/共87页第52页/共87页3.3.3 3.3.3 插入载体和置换载体插入载体和置换载体解决包装限制和多酶切位点的问题后，就可以着手开发各种基于解决包装限制和多酶切位点的问题后，就可以着手开发各种基于噬菌体的克隆载体。噬菌体的克隆载体。最

43、先产生的两类载体最先产生的两类载体: : 插入载体插入载体(insertion) 置换载体置换载体( (替换载体替换载体) ) (replacement)第53页/共87页插入载体插入载体插入载体的构建过程：插入载体的构建过程： 去掉一大段非必需片段，剩下的两段再连去掉一大段非必需片段，剩下的两段再连接起来。接起来。 为了顺利地插入新的为了顺利地插入新的DNADNA，一个插入载体必，一个插入载体必须至少包含一个单酶切位点。须至少包含一个单酶切位点。 插入的插入的DNADNA片段的长度依赖于删除掉的非必片段的长度依赖于删除掉的非必需片段的长度。需片段的长度。第54页/共87页两个常用的插入载体：

44、两个常用的插入载体：(1)(1)gtl0gtl0 可以插入超过可以插入超过8kb8kb的外源的外源DNADNA。外源。外源DNADNA通通过过EcoEcoRIRI单酶切位点插入单酶切位点插入c cI I基因，并使该基基因，并使该基因失活，使得重组体的噬菌斑是清澈的而不因失活，使得重组体的噬菌斑是清澈的而不是混浊的。是混浊的。 (2)(2)ZAPZAP 可以插入超过可以插入超过10kb10kb的外源的外源DNADNA。携带的。携带的lacZlacZ基因上有一个多接头，外源基因插入基因上有一个多接头，外源基因插入到这个多接头上到这个多接头上6 6个酶切位点中的任何一个，个酶切位点中的任何一个，都会

45、使该基因失活，从而使重组体的噬菌斑都会使该基因失活，从而使重组体的噬菌斑是无色清澈的而不是蓝色的。是无色清澈的而不是蓝色的。第55页/共87页第56页/共87页置换载体置换载体一个一个置换载体有克隆所需限制性内切酶识置换载体有克隆所需限制性内切酶识别的两个位点，而在这两个位点之间的别的两个位点，而在这两个位点之间的DNADNA片段将会被外源的片段将会被外源的DNADNA所置换。所置换。通常被置换的那段通常被置换的那段DNADNA（克隆术语中称为填充（克隆术语中称为填充片段）含有其他的一些限制性酶切位点，可片段）含有其他的一些限制性酶切位点，可被切成许多小片段，因此在克隆实验中它重被切成许多小片

46、段，因此在克隆实验中它重新被插入的可能性相当小。新被插入的可能性相当小。置换载体可携带的置换载体可携带的DNADNA片段长度通常超过插入片段长度通常超过插入载体。载体。重组体的筛选往往基于它的大小：没有重组重组体的筛选往往基于它的大小：没有重组的载体因为太小而不能被包装进入的载体因为太小而不能被包装进入噬菌体噬菌体的头部。的头部。第57页/共87页第58页/共87页两个常用的置换载体：(1)(1)EMBL4EMBL4 可以携带超过可以携带超过20kb20kb的外源的外源DNADNA。 在填充片段的两边有成对的在填充片段的两边有成对的EcoEcoRIRI，BamBamHIHI和和SalSalI

47、I的酶切位点。的酶切位点。 用这用这3 3种酶中的任意一种进行酶切都可以除种酶中的任意一种进行酶切都可以除去填充片段，所以可以支持有不同黏性末端去填充片段，所以可以支持有不同黏性末端的的DNADNA。 重组体的筛选可以基于它的大小，也可以重组体的筛选可以基于它的大小，也可以应用应用SpiSpi表型。表型。第59页/共87页第60页/共87页(2)(2)GEM11GEM11和和GEMl2GEMl2 都可以携带都可以携带23kb23kb的外源的外源DNADNA（接近理论上（接近理论上的最大值）。的最大值）。 在填充片段的两边各有一个多接头，含有在填充片段的两边各有一个多接头，含有7 7个不同的限制

48、性酶切位点。个不同的限制性酶切位点。 这两个载体多接头略有不同，但这两个载体多接头略有不同，但最外面的最外面的一个都是一个都是SfiSfiI I酶切位点酶切位点(GGCCNNNNNGGCC)(GGCCNNNNNGGCC)。这个序列极其罕见，不太可能出现在被克隆这个序列极其罕见，不太可能出现在被克隆的的DNADNA片段中。片段中。 因此可以用因此可以用SfiSfiI I把克隆后的把克隆后的DNADNA片段完整片段完整地切下来。地切下来。 和和EMBL4EMBL4相似，可以根据大小和相似，可以根据大小和SpiSpi表型表型筛选重组体。筛选重组体。第61页/共87页第62页/共87页第63页/共87

49、页3.3.4 3.3.4 用用插入载体或置换载体插入载体或置换载体进行克隆实验进行克隆实验用用噬菌体载体进行克隆和用质粒载体相似：噬菌体载体进行克隆和用质粒载体相似： 限制性酶酶切载体，加入新的限制性酶酶切载体，加入新的DNADNA，连接混，连接混合物，产物分子转染大肠杆菌。合物，产物分子转染大肠杆菌。 这种实验需要把载体通过这种实验需要把载体通过coscos位点由氢键连位点由氢键连接，以环状分子形式存在。接，以环状分子形式存在。这种转染的方法在大多数情况下令人满意，这种转染的方法在大多数情况下令人满意，但效率不高。但效率不高。如果增加一两步操作，可以获得更多的重组如果增加一两步操作，可以获得

50、更多的重组体体。第64页/共87页首先，要使用首先，要使用噬菌体载体的线状分子。噬菌体载体的线状分子。 当线状分子被相应的酶酶切后，便形成了当线状分子被相应的酶酶切后，便形成了左右两个相互分离的片段。左右两个相互分离的片段。 连接被克隆的连接被克隆的DNADNA和载体的左右两个片段，和载体的左右两个片段，连接的结果可能有好几种不同的排列，其中连接的结果可能有好几种不同的排列，其中包含一些由重复序列组成的连环体，重复的包含一些由重复序列组成的连环体，重复的单位是：单位是：载体的左片段载体的左片段被克隆的被克隆的DNADNA载体的右片段。载体的右片段。 如果被插入的如果被插入的DNADNA是正确的

51、大小，那么分隔是正确的大小，那么分隔这些重复序列的这些重复序列的coscos相隔正确的距离，能够相隔正确的距离，能够用于体外包装。产生重组后的噬菌体可以感用于体外包装。产生重组后的噬菌体可以感染大肠杆菌。用这种方法，经过体外包装，染大肠杆菌。用这种方法，经过体外包装，可以获得大量的重组分子。可以获得大量的重组分子。第65页/共87页第66页/共87页3.3.5 3.3.5 用黏端质粒对大的用黏端质粒对大的DNADNA片段进行克隆片段进行克隆基于基于噬菌体的克隆载体中，最复杂的形式噬菌体的克隆载体中，最复杂的形式是黏端质粒。是黏端质粒。黏端质粒是噬菌体黏端质粒是噬菌体DNADNA和大肠杆菌质粒两

52、者的和大肠杆菌质粒两者的杂交体。杂交体。设计的基础：设计的基础： 把噬菌体把噬菌体DNADNA装进噬菌体头部的酶，仅仅只装进噬菌体头部的酶，仅仅只需要被包装的分子拥有需要被包装的分子拥有coscos位点就能够发挥位点就能够发挥作用。作用。 在体外包装系统中除了在体外包装系统中除了基因组外，任何基因组外，任何长度在长度在37kb37kb和和52kb52kb之间的之间的DNADNA分子，只要两分子，只要两端含有端含有coscos位点，就能被包装进噬菌体头部。位点，就能被包装进噬菌体头部。第67页/共87页第68页/共87页黏端质粒基本上算是一个携带cos位点的质粒。因为它缺少所有的因为它缺少所有的

53、噬菌体基因且不能产生噬菌体基因且不能产生噬菌斑，因此它需要有其他的筛选标记，如噬菌斑，因此它需要有其他的筛选标记，如氨苄青霉素耐药性基因，也要有质粒复制起氨苄青霉素耐药性基因，也要有质粒复制起点。点。采用黏端质粒的克隆实验步骤如下采用黏端质粒的克隆实验步骤如下: : 从单酶切位点切开黏端质粒从单酶切位点切开黏端质粒; ; 加入新的加入新的DNADNA片段片段( (这些片段通常是不完这些片段通常是不完全酶切的产物，完全酶切后产生的片段对于全酶切的产物，完全酶切后产生的片段对于黏端质粒来说太小了黏端质粒来说太小了);); 进行连接反应，形成连环体。进行连接反应，形成连环体。 第69页/共87页如果

54、插入的如果插入的DNADNA大小合适，体外包装系统从大小合适，体外包装系统从coscos位点切开连环体，把重组后的黏端质粒位点切开连环体，把重组后的黏端质粒包装进成熟的噬菌体颗粒。包装进成熟的噬菌体颗粒。用这些用这些噬菌体去感染大肠杆菌，但不会产噬菌体去感染大肠杆菌，但不会产生噬菌斑，把感染后的大肠杆菌培养在选择生噬菌斑，把感染后的大肠杆菌培养在选择性培养基平板上，只有那些有抗生素抗性的性培养基平板上，只有那些有抗生素抗性的菌落才能生长。菌落才能生长。所有的菌落都是重组体，因为那些没有重组所有的菌落都是重组体，因为那些没有重组的线性的黏端质粒太小，根本不可能被包装的线性的黏端质粒太小，根本不可

55、能被包装进噬菌体头部。进噬菌体头部。第70页/共87页第71页/共87页3.4 3.4 载体和其他高容量的载体载体和其他高容量的载体使基因组文库得以建立使基因组文库得以建立基于基于噬菌体的载体的主要用途是克隆那些噬菌体的载体的主要用途是克隆那些不能被质粒或不能被质粒或M13M13载体所操作的载体所操作的DNADNA大片段。大片段。插入的外源插入的外源DNADNA片段：片段： M13M13载体：不超过载体：不超过3kb3kb 质粒：不超过质粒：不超过8kb8kb 置换载体置换载体EMBL4EMBL4：达到：达到20kb20kb 某些黏端质粒：某些黏端质粒：40kb40kb。第72页/共87页这种

56、可以克隆如此之大的这种可以克隆如此之大的DNADNA片段的能力，使片段的能力，使得人们可以建立基因组文库。得人们可以建立基因组文库。基因组文库：基因组文库：一套覆盖某个生物体所有一套覆盖某个生物体所有DNADNA的重组体克隆。的重组体克隆。例如，一个大肠杆菌的基因组文库，包含所例如，一个大肠杆菌的基因组文库，包含所有的大肠杆菌基因。有的大肠杆菌基因。据此，可以抽提出任何我们所感兴趣的基因据此，可以抽提出任何我们所感兴趣的基因加以研究。基因组文库可以保存很多年，也加以研究。基因组文库可以保存很多年，也可以很容易在研究组织间相互传播。可以很容易在研究组织间相互传播。第73页/共87页当要建立基因组

57、文库时，面临一个重要的问题：一个基因组文库到底需要多当要建立基因组文库时，面临一个重要的问题：一个基因组文库到底需要多少个克隆少个克隆? ?可以用下面的公式计算：可以用下面的公式计算：N=ln(1-N=ln(1-P P) )ln(1-aln(1-ab)b)N N指所需要的克隆的个数，指所需要的克隆的个数，P P是得到所有基因的可能性，是得到所有基因的可能性，a a是插入到载体中去是插入到载体中去的的DNADNA片段的平均大小，片段的平均大小，b b是基因组的大小。是基因组的大小。第74页/共87页第75页/共87页从几十万个克隆中一个个筛选出感兴趣的基从几十万个克隆中一个个筛选出感兴趣的基因是

58、不明智的。因是不明智的。减少克隆数的方法：减少克隆数的方法：方法一：开发能够携带更大方法一：开发能够携带更大DNADNA片段的克隆载片段的克隆载体。体。细菌人工染色体（细菌人工染色体（BACsBACs）：）： 基于基于F F质粒构建的新载体。质粒构建的新载体。 F F质粒相对较大，由它开发的载体有着比普质粒相对较大，由它开发的载体有着比普通质粒载体大很多的容量。通质粒载体大很多的容量。 BACBAC能够插入能够插入超过超过300kb300kb的的DNADNA片段，由此片段，由此使人类基因组文库的克隆数下降到使人类基因组文库的克隆数下降到30 00030 000个。个。第76页/共87页基于噬菌

59、体基于噬菌体P1P1发展而来的载体发展而来的载体 P1P1优于优于的地方：能够在它的蛋白质外壳的地方：能够在它的蛋白质外壳中挤进中挤进110kb110kb的的DNADNA。基于噬菌体基于噬菌体P1P1设计的黏端质粒可以用于克隆设计的黏端质粒可以用于克隆长度从长度从75 kb75 kb到到100kb100kb的的DNADNA。还有一种载体，结合了还有一种载体，结合了P1P1载体和载体和BACBAC的特点，的特点，称为称为由由P1P1衍生的人工染色体衍生的人工染色体(P1-derived (P1-derived artificial chromosomeartificial chromosome，

60、PAC)PAC)，同样也，同样也拥有超过拥有超过300kb300kb的容量。的容量。第77页/共87页3.5 3.5 其他细菌的克隆载体其他细菌的克隆载体人们还开发了为其他一些细菌服务的载体。人们还开发了为其他一些细菌服务的载体。这些载体中，这些载体中， 有的只对特定宿主有效的质粒载体；有的只对特定宿主有效的质粒载体； 有的是能够在许多宿主中复制的广谱宿主有的是能够在许多宿主中复制的广谱宿主质粒；质粒； 还有少数几个是从噬菌体开发出来的克隆还有少数几个是从噬菌体开发出来的克隆载体。载体。大多数这些载体的性质和用法都和大肠杆菌大多数这些载体的性质和用法都和大肠杆菌的载体很相似。的载体很相似。第7