基因工程所需的基本条本

1、基因工程所需的基本条本基因工程操作过程第1页/共203页 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。第2页/共203页 一类来源于原核生物的，能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列（回文序列，48bp），并切割DNA双链,使磷酸二酯键断开的核酸内切酶。 1.定义第一节 限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease ）第3页/共203页II型限制性内切酶：同型二聚体结构与DNA双链结合，两个催化Mg2+与DNA裂解位点相邻限制性内切酶EcoR

2、I的结构第4页/共203页 （2）修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护,不能被自身的限制性内切酶识别切割。2、细菌的限制和修饰系统（R/M体系）（1）限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。第5页/共203页研究发现，限制-修饰系统广泛存在在原核细菌中，与三个连锁基因相关：Genes for restriction-modification enzymes are often clustered together in a region called an immigration control region.

3、The immigration island from E. coli K-12 is about 14 Kbp. 第6页/共203页噬菌体DNA进入细菌后，其基因组DNA被降解第7页/共203页3、类型分类的主要依据： 亚单位组成 识别序列的种类 是否需要辅助因子 分三类(I, II ,III) 第8页/共203页第9页/共203页 （1）酶结构三亚基，包括：R（限制酶亚基）；M（甲基化酶亚基）；S（识别DNA序列亚基）（2）切割位点切割位点在识别位点1000 bp以外，无特异性4、I型限制性内切酶首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的，如 E

4、coB和 EcoK，研究较少。Recognize sitecut1-1.5kb第10页/共203页（3）结合方式 I类限制性内切酶与DNA结合依赖M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用。 第11页/共203页例子：EcoB的识别序列为T-G-A*-N8-T-G-C-TA-C-T-N8-A*-C-G-AEcoK的识别序列为A-A*-C-N8-G-T-G-CT-T-G-N8-C-A*-C-G第12页/共203页 2. II类限制性内切酶(93%) （1）酶结构 修饰和限制活性由分开的两个酶(甲基化酶和限制性内切酶)来完成，其中甲基化酶由一条肽链构成，限制酶由相反方向结合的同源二聚体构

5、成。 第13页/共203页 （2）识别序列 DNA双链上的回文对称序列（旋转对称序列，反向重复序列），一般长4-8bp ，与DNA的来源无关。 EcoR I： 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5EcoR V 第14页/共203页EcoR I 5EcoR I 5-GAATTC-3-GAATTC-3 3 3-CTTAAG-5-CTTAAG-5 Pst I 5Pst I 5-CTGCA-CTGCAG-3G-3 3 3-G-GACGTC-5ACGTC-5 产生粘性末端产生粘性末端EcoR V 5EcoR V 5-GAT-GATATC-3ATC-3 3 3-CTA-CTATAG-5TAG-5 产

6、生平齐末端产生平齐末端（3）切割位点识别位点处切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。第15页/共203页几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 第16页/共203页（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端分两种类型： 5端凸出（如EcoR I切点）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 第17页/共203页EcoR

7、I等产生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHP第18页/共203页Pst I等产生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-

8、C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP第19页/共203页PvuII等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 第20页/共203页粘性末端促进连接便利 i）不

9、同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。第21页/共203页第22页/共203页识别相同序列的限制性内切酶称同裂酶。 （5）同裂酶（Isoschizomers)同序同切酶（完全同裂酶）： 识别位点和切点完全相同。 如Hind 和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 第23页/共203页识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。 同序异切酶（不完全同裂酶）：Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sm

10、a I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 第24页/共203页 识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等 （6）同尾酶(Isocaudamers） 第25页/共203页 Sau 3A 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。BamH IBgl BamH IBgl Sau 3A第26页/共203页（7）DNA末端长度对限制酶切割的影响Pst IG GCTGCAGCTGCAGC C TGCATGCACTGCAGCTGCAGTGCA TGCA AAAACTGCAGCTGCAGAACCAAAACCAA0 10 90

11、0 10 90 EcoR I G GGAATTCGAATTCC C CGCGGAATTCGAATTCCG CG CCGCCGGAATTCGAATTCCGG CGG 90 90 90 90 90 90第27页/共203页（8）酶切反应条件缓冲液：MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度 Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定反应温度：大多数为37反应时间：通常1h,许多酶延长反应时间可减少酶量终止酶切的方法：a、10mM/LEDTAb、加热，大多数酶可用65温育20分钟失活C、苯酚抽提蛋白，然后用乙醇沉淀DNA第2

12、8页/共203页 一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，50L反应体系中完全降解1g DNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：A DNA的纯度和甲基化程度B 甘油的含量（不超过5%）C 反应体系中的离子强度D 反应体系的pH值F 反应的温度条件（通常为37 ）Buffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 酶单位的定义和影响酶活性的因素第29页/共203页酶 切 反 应 的 基 本 步 骤电泳紫外分析37 1h加反应液CKM1.0kb1.0kb0.4kb0.5

13、kb0.6kbCKMTT酶量的确定：2-3 倍才能保证完全消化；第30页/共203页（10）双酶切反应1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切2）对盐浓度要求不同的酶，也可采取同步双酶切：选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。3）如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。第31页/共203页第32页/共203页 3. III类限制性内切酶（1%） 由R亚基和MS亚基二亚基组成双功能酶，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。在切割位点下

14、游24-26bp处，反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖ATP。修饰作用和切割作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行。切割序列位于识别位点一侧若干碱基对处，无序列特异性。在基因工程操作中用途不大。 第33页/共203页EcoP15I M.EcoP15I 第34页/共203页1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： 三、限制性内切酶的命名 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血

15、菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。2. 用一个大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。第35页/共203页限制性核酸内切酶的命名第36页/共203页四、影响限制性内切酶活性的因素1. DNA的纯度 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 一般采取纯化DNA，如用2.5倍体积的冰冷乙醇沉淀加大酶的用量 延长保温时间 扩大反应体积（ 20l）第37页/共203页2.DNA的甲基化程度大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：da

16、m甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株！第38页/共203页3. 温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC ，少数要求40-65 oC 。酶酶最适最适温度温度o oC C酶酶最适最适温度温度o oC C酶酶最适最适温度温度o oC CApa I Apa I Bcl I Bcl I Mae II Mae II 30 30 50 50 50 50 Apy I Apy I BstE II BstE II Mae IIIMae III30 30 60 60 5555Ban I Ban I Mae I M

17、ae I Sma ISma I50 50 45 45 2525第39页/共203页4. 缓冲液(Buffer)是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定； 第40页/共203页第二节 基因工程中常用的DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow 片段3. T4 噬菌体DNA聚合酶4. T7 噬菌体DNA聚合酶 5. 反转录酶6.末端转移酶第41页/共203页1. 共同特点把dNTPs

18、连续地加到引物的3OH端。2.主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。 如：T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。常用的DNA聚合酶的特点第42页/共203页1. 大肠杆菌DNA聚合酶 I（1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA Pol I）的性质一条多肽单链53 DNA聚合酶活性53外切酶活性，位于N端，用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分，就成为Klenow fragment 3 5外切酶活性。 第43页/共203页 底物： dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） M

19、g2+ 带有3OH游离端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I的反应条件-OH5 3 dNTPs第44页/共203页5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 （3）DNA聚合酶I基本用途：制备32P标记的探针DNAase IDNA Pol IMg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a-

20、32P-dATP）DNAase I：为一内切核酸酶，它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA，形成单链切口 第45页/共203页2. Klenow fragment（1）Klenow fragment的性质具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草杆菌蛋白酶第46页/共203页 3端补平补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。5 5 klenow DNA 3末端标记在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途第47页/共203页3隐蔽末端的DNA片断Klenow fragment补平根据

21、末端的顺序选择一种 a-32P-dNTPs末端标记的DNA 限制性内切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH Ia-32P-dATPa-32P-dGTP25oC 1h第48页/共203页（1） T4 DNA聚合酶的性质从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。有53聚合酶活性和35外切酶活性（约为Klenow 片段活性的200倍）。3. T4 DNA聚合酶用35外切酶活性作用于末端制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶

22、活性补平，并加入放射性标记的dNTP。第49页/共203页5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶无dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs5 5 当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。当有dNTP时， T4DNA聚合酶行使53聚合酶功能，填平3隐蔽端。第50页/共203页5. 逆转录酶 依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶），来源于RNA肿瘤病毒,最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）。作用：以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合），合成cDNA。

23、AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA第51页/共203页不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 末端转移酶Mg2+ dATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH3 p 5 6.末端转移酶来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的DNA聚合酶。可在cDNA或载体的3末端加同聚物尾巴，便于克隆。第52页/共203页一、连接酶1. 两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶:只能连接粘性末端。（2）T4噬菌体的连接酶:不但能连接粘性末端,还能连接齐平末端。2. 连接条件（1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA3端有游离的-OH,5端有一个磷酸基团。（3

24、）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中: NAD+第三节 其它分子克隆工具酶第53页/共203页OHP3、功能：（1）修复DNA链上切口处的磷酸二酯键：T4-DNA连接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5nick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5第54页/共203页（2）连接多个平头双链DNA分子：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P

25、-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA连接酶第55页/共203页4、 连接反应的温度最佳温度：连接酶反应的最佳温度是37C。实用温度：在37下粘性末端的结合很不稳定，所以一般采用 416 C。插入片段与载体的浓度比例： 1020倍（摩尔之比）目的：增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。第56页/共203页DNA连接酶DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50 - 100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1 mMDTT5 mMVolume10 - 20 ul4 - 15 4 - 16 hr

26、1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下16 反应 1 小时，完全连接 1 g -DNA（Hind III片段）所需的酶量第57页/共203页 二、碱性磷酸酶1. 碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来，具有抗热性。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来，SDS中加热68oC可完全失活。第58页/共203页2. 碱性磷酸酶的特性催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3 P-OH5 3 HO-P5 5 3 HO-OH5 3

27、 HO-OH碱性磷酸酶3. 碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体分子自我连接第59页/共203页单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTT TTCGAAHind酶切A-OH TTCGA-PP-AGCTT HO-A碱性磷酸酶5 5 5 第60页/共203页A-OH TTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。但同一酶切后的外源DNA的5端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。第61页/共203页ATTCGA AGCTT AAGCTTA A TTCGA 连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3 P-AGCT

28、TA-OH5 3 HO-ATTCGA-P5 外源DNA第62页/共203页四、核酸酶1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII） 大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII35353535第63页/共203页2、双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切ExoIII3535Mg2+3535第64页/共203页Exo3535Mg2+3、双链核酸外切酶：核酸外切酶（ Exo） 核酸外切酶特异性地从5 端外切3535第65页/共203页4、单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus

29、 oryzae）降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍Zn2+必需最适pH范围为4.0 - 4.3需要NaCl 10 - 300 mM降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍第66页/共203页一、载体的功能及特征1、定义：把目的基因通过运载工具送到受体细胞内，这种运载工具就叫载体（vector)。2、载体的特征1）在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制起点）2）具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，供外源DNA片断插入，同时不影响复制3）有一定的选择标记，用于筛选第四节 用于基因克隆的载体第67页/共203页质粒载体（plasmid） 噬菌体载体（phage）动物病毒（viru

30、s） 噬菌粒载体考斯质粒（cosmid） 人造染色体（artifical chromosome）第68页/共203页二、质粒载体 质粒（plasmid）：独立于染色体以外的能自主复制的双链、共价、闭合、环状DNA分子,大小范围在1kb-200kb以上不等。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。第69页/共203页致育质粒，F质粒（fertility plasmid），编码有性生殖功能，带有F质粒的细菌为雄性菌，能长出性菌毛，无F质粒的细菌为雌性菌，无性菌毛。 耐药性质粒编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性，耐药性质粒分为二类，其中可以通过细菌间的接合进行传递的称接合性耐药质粒，又称R质粒(r

31、esistance plasmid)。另一类是不能通过接合传递的非接合性耐药质粒，但它可通过噬菌体传递。细菌粘附定植在肠粘膜表面是由K质粒决定的。 细菌素质粒编码各种细菌产生细菌素，如Col质粒编码大肠杆菌素，对同品系或近缘的细菌具有抑制作用，实际是对产生细菌素细菌本身起保护作用。 代谢质粒编码产生相关的代谢酶，如沙门菌发酵乳糖的能力通常是由质粒决定的。 细菌携带有哪种质粒，则有相应的功能，但也有某种质粒可同时决定几种功能，如F质粒除有致育性功能外，还能提供辅助质粒转移的能力，某些耐药性质粒上还带有编码毒力的基因，故带此种质粒的细菌，不仅获得了耐药性，而且致病性也得到了增强。毒力质粒或Vi质粒

32、（virulence plasmid）编码与该菌致病性有关的毒力因子。第70页/共203页 天然质粒用作载体的局限性天然质天然质 粒粒 相对分子质量相对分子质量拷贝数拷贝数单一酶切位点单一酶切位点选择性标记选择性标记复制类型复制类型pSC1015.81069.09 kb13EcoR Itetr严紧严紧ColE14.210620EcoR I大肠杆菌素大肠杆菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I (BamH I)ampr松弛松弛局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适第71页/共203页 共价闭合环状DNA（ Covalent close circular

33、DNA， cccDNA)，呈超螺旋（super coil ，SC ）一条链上有一至数个缺口。DNA超螺旋结构第72页/共203页质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。SCOCL第73页/共203页2 2、质粒的基本性质、质粒的基本性质 1 1）质粒的自主复制性）质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制。复制系统进行自主复制。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型。可分为两大复制类型。 严紧型质

34、粒（严紧型质粒（stringent plasmidstringent plasmid）拷贝数少拷贝数少，大约有大约有1-1-几个拷贝。几个拷贝。 松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmidrelaxed plasmid）拷贝数多拷贝数多，有，有10106060份拷贝。份拷贝。 第74页/共203页2 2）质粒的不相容性）质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒质粒的不相容性的不相容性，不相容性的质粒组成，不相容性的质粒组成不相容性群。不相容性群。以大肠

35、杆菌的质粒为例：以大肠杆菌的质粒为例： ColE1ColE1、pMB1 pMB1 拥有相拥有相似的复制子结构，彼此不相容；似的复制子结构，彼此不相容； pSC101pSC101、F F、RP4 RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容。拥有相似的复制子结构，彼此不相容。第75页/共203页质粒的不相容性分子机制： 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定。因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，由于竞争作用致使两种质粒的最终拷贝数不同，其

36、中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。 第76页/共203页质粒不亲和性a：在同一个细胞中含有两种不相容的质粒b：随着细胞的分裂质粒分配到两个子细胞中去c：在下一次细胞分裂之前，质粒拷贝数加倍，但因为存在竞争，增加拷贝数不同d：两种不相容质粒拷贝数比例发生变化，最终产生出只含有一种类型质粒的子细胞第77页/共203页在大肠杆菌中的质粒，可以分为：接合型质粒:能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），多为低拷贝的大质粒，含有完整的转移操纵子基因（tra）和转移起始位点。能在同种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用，多为高拷

37、贝的小质粒，如大肠杆菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少转移基因（tra），不能自主转移，但由于含有与F质粒类似的bom位点或诱动基因mob（mobilization），因而能被带有tra基因的转移性质粒诱动而发生转移。 3 3）质粒的转移性）质粒的转移性第78页/共203页F因子：又叫致育因子，在某些大肠杆菌中发现的一种最具代表性的单拷贝的接合型质粒，94kb，总共编码19个转移基因（tra），以三种形式存在。第79页/共203页 3 3、质粒上的标记基因、质粒上的标记基因 野生型的质粒野生型的质粒DNADNA上往往携带一个或多个遗传标上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产

38、生正常生长非必需的附记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，但是加性状，但是对对DNADNA重组分子的筛选具有重要意义重组分子的筛选具有重要意义 包括：包括： 物质抗性：物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物机物 物质合成：物质合成：细菌毒素、天然色素、有机碱细菌毒素、天然色素、有机碱第80页/共203页第81页/共203页第82页/共203页第83页/共203页标记基因用途：1）选择标记基因：鉴别目的DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。2）筛选标记基因：用于将携带了外源DNA片断的重组子挑选出来。第84页/共203页4

39、、质粒的命名 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。第85页/共203页1）克隆载体（cloning vector） ： 主要用于扩增或保存DNA片断，其上有复制子，最好是松弛型高拷贝；2）表达载体（expression vector）： 能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；3）穿梭载体（shuttle vector）： 装有针对两种

40、不同受体的复制子，便于基因克隆。 这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。第86页/共203页1）克隆载体天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。第87页/共203页 pSC101 8.8 kb,拷贝数5、四环素抗性标记基因 TetrColE1 6.5 kb,拷贝数20 30、大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ColE1衍生质粒、氨苄青霉素抗性标记基因 Ampr第88页/共203页组成:它由三部分组成：来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr来自RSF

41、2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori第89页/共203页pBR322质粒载体的结构来源第90页/共203页特点特点: :具有多个单一的限制性内切酶位点。 Tetr中有BamH1切点（GGATCC）和Sal切点（GAATTC），Ampr中有Pst切点（CTGCAG）。利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的。第91页/共203页外源基因插入在Tetr中，基因型为Tets Ampr ；外源基因插入在Ampr中，基因型为Tetr Ampr；Tetr：在含有四环素培养基可生长；Tets：在含四环素培养基上不生长；Ampr：在含有氨卞青霉素培养基

42、上不生长；Amps：在含有氨卞青霉素培养基上可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。 这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活（insertional inactivation ）。 第92页/共203页pBR322质粒载体tetr基因插入失活效应第93页/共203页常用质粒克隆载体：常用质粒克隆载体：pUCpUC系列系列 pUC18/19特点：具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷贝数（500-700个）。具有多克隆位点，很方便插入外源基因-互补含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因)第94页/共203页第95页/共203页OHHH

43、OHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONNpUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal-半乳糖苷酶的-肽段lacZMCSPlac突变型lac - E.coli溴氯吲哚第96页/共203页LacZ: 大肠杆菌的编码-半乳糖苷酶基因，编码1024个氨基酸，切断乳糖的半乳糖苷键产生半乳糖和葡萄糖 LacZ: 编码-半乳糖苷酶N端146个氨基酸 ，这个编码区中插入了一个MCS，但它并不破坏读框，但是，若在该 DNA 小片段中再插入一个片段，将几乎不可避免地导致产生无-互补能力的 -半乳糖苷酶片段X-gal ：5-溴-4-

44、氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷，也是-半乳糖苷酶的一种生色底物，经降解后可生成溴氯吲哚，呈蓝色，也使大肠杆菌菌落从白色转变为蓝色第97页/共203页-互补(Alpha complementation) ： 质粒中插入lac Z基因，编码N端146个氨基酸残基（ -半乳糖苷酶的片段）。突变型lac - E.coli 可表达该酶的片段（酶的C端）。单独存在的及片段均无半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使底物X-gal特异性变为蓝色化合物，这就是所谓的 - 互补。 Blue White第98页/共203页2）真核表达质粒酵母表达质粒昆虫表达质粒

45、哺乳动物细胞表达质粒第99页/共203页第100页/共203页启动子（promoter）：是与基因表达启动相关的顺式作用元件，与RNA聚合酶特异结合，是基因转录的起始部位，分为两类：一类是RNA聚合酶能够直接识别的，另一类在与RNA聚合酶结合时需要蛋白质辅助因子存在。序列特点：上游有-10，共同序列TATAAT （Pribnow box）；上游有-35，共同序列TTGACA第101页/共203页lLac启动子（Plac）：中等强度启动子，一般带有lacZ基因片段，实现-互补。l噬菌体左臂（PL)和右臂启动子（PR) ：是噬菌体早期左臂和右臂转录控制区，启动效率高，广泛使用的原核生物启动子。lT

46、rp启动子（Ptrp）：是强启动子，来源于大肠杆菌色氨酸操纵子， 在富含trp的培养基中处于关闭状态，当trp水平下降，Ptrp开始转录。lT7启动子（PT7）：来自于T7噬菌体晚期转录基因启动子，只能由T7聚合酶识别（其转录活性是大肠杆菌聚合酶6倍，因此PT7转录活性高。第102页/共203页lac 操纵元结构调节序列结构基因操纵子：以乳糖操纵子为例来说明第103页/共203页异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)就是其中一种很强的诱导剂，不被细胞代谢而十分稳定。第104页/共203页核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS

47、）：大肠杆菌中翻译起始时，首先是核糖体30S小亚基识别并结合至mRNA5端的翻译起始部位，该部位就是RBS。RBS包括起始密码子ATG序列及其上游SD序列。SD序列：ATG上游311碱基处的保守序列AGGAG，可与小亚基中16S rRNA 3端富含嘧啶序列互补结合，mRNA必须有这一序列才能进入核糖体。第105页/共203页转录终止区（terminator）：是DNA分子中决定RNA聚合酶终止转录的一段回文核苷酸序列。分为两类：不依赖因子的终止子的回文序列中富含GC碱基对，在回文序列的下游方向又常有68个AT碱基对；而依赖因子终止子中回文序列的GC对含量较少。在回文序列下游方向的序列没有固定特

48、征，其AT对含量比前一种终止子低。 第106页/共203页大肠杆菌中蛋白表达形式大肠杆菌中蛋白表达形式 (1)(1)完整目的蛋白完整目的蛋白 (2)(2)融合蛋白融合蛋白：两个或多个基因的开放阅读框按一定顺序连两个或多个基因的开放阅读框按一定顺序连接在一起表达形成的蛋白。接在一起表达形成的蛋白。 当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。通过以融合蛋白的形式表达，并利用目标蛋白的关键因素。通过以融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离

49、和纯化。用作分离的载体蛋白被称为纯化。用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽标签蛋白或标签多肽（TagTag），），常用的有谷胱甘肽转移酶（常用的有谷胱甘肽转移酶（glutathione S-glutathione S-transferase, GSTtransferase, GST）、六聚组氨酸肽（）、六聚组氨酸肽（polyHis-6polyHis-6，6 6His His tagtag）、金黄色葡萄球菌蛋白质）、金黄色葡萄球菌蛋白质A A或或G G（protein A, protein protein A, protein G G ）等。）等。第107页/共203页融合蛋白的表达载体（

50、1）GST融合表达载体GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli易表达，在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。第108页/共203页 GST表达载体在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列，其一是谷胱甘肽转移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位点的编码序列。当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。 将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出

51、来。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可获得纯化的目标蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位点外，其它还有肠激酶。第109页/共203页（2）his(组氨酸）标签表达载体启动子下游有一段编码6个组氨酸的序列，多聚组氨酸肽能与2价金属离子结合（镍离子），将镍离子固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离。第110页/共203页 真核表达载体真核表达载体l 酵母表达载体酵母表达载体l 昆虫表达载体昆虫表达载体l 哺乳动物细胞表达载体哺乳动物细胞表达载体 第111页/共203页 l酵母表达载体酿酒酵母和毕赤酵母毕赤酵母载体:均为大肠杆菌-毕赤酵母穿梭载体第112页/共203页毕赤酵母启动子（来自乙

52、醇氧化酶基因AOX1），受到甲醇严格控制。第113页/共203页l哺乳动物细胞表达质粒载体包括:1）大肠杆菌的复制子及抗生素抗性基因：便于基因工程操作2）哺乳动物的启动子和增强子：使外源基因表达3）含有终止信号及加polyA信号：polyA上游1130bp处有一高度保守的AAUAAA序列，下游富含GU或U第114页/共203页Neomycin：G418第115页/共203页绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）：从水母体内发现的发光蛋白，分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其

53、发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 如利用GFP 的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。 第116页/共203页内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）。 IRES能招募核糖体对mRNA进行独立地翻译。第117页/共203页3）穿梭质粒 穿梭载体（Shuttle vector）是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。这类载体可以在原核细胞中复制，也可在

54、真核细胞中扩增和表达。 酵母、昆虫、哺乳动物细胞等使用的表达载体，一般都有在大肠杆菌中复制的元件，因此都具备穿梭载体的特征，如大肠杆菌/酵母、大肠杆菌/昆虫细胞、大肠杆菌/哺乳动物细胞穿梭载体等。 第118页/共203页5、质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列2种方法制备质粒DNA： 1)氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染2)碱裂解法方便、快速，满足一般需要第119页/共203页1 1）氯化铯密度梯度离心法：）氯化铯密度梯度离心法： 原理：是一种沉降平衡离心法，经超速离心，离心介质原理：是一种沉降平衡离心法，经超速离心，离心介质CsClCsCl形成形成一连续

55、的密度梯度，在过量一连续的密度梯度，在过量EBEB存在的条件下，各种不同密度的物存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度小（质经离心平衡后得以分开。其中蛋白质密度小（1.3 g/cm31.3 g/cm31.4g/cm31.4g/cm3），浮于液面；），浮于液面；RNARNA密度大（密度大（2.0g/cm32.0g/cm3），沉于管底；），沉于管底；各种各种DNADNA密度介于蛋白质与密度介于蛋白质与RNARNA之间，处于中部。过量之间，处于中部。过量EBEB处理前，处理前，细菌染色体细菌染色体DNADNA与不同分子构型的质粒与不同分子构型的质粒DNADNA的密度均为

56、的密度均为1.7g/cm31.7g/cm3左左右，难以区分。经过量右，难以区分。经过量EBEB处理后，不同分子构型的处理后，不同分子构型的DNADNA与与EBEB的结合的结合能力不一样，因而密度下降不一致，可有效分离。其中，闭环质能力不一样，因而密度下降不一致，可有效分离。其中，闭环质粒粒DNADNA为超螺旋三级结构，为超螺旋三级结构，EBEB不易插入，结合量少，密度下降小，不易插入，结合量少，密度下降小，约为约为1.59 g/cm31.59 g/cm3；而染色体；而染色体DNADNA、开环质粒、开环质粒DNADNA以及带切口的环状以及带切口的环状质粒质粒DNADNA可以嵌入更多的可以嵌入更多

57、的EBEB，密度下降较多，约为，密度下降较多，约为1.54 g/cm31.54 g/cm3，从而能与闭环质粒从而能与闭环质粒DNADNA分开。分开。 第120页/共203页proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs过程：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNA第121页/共203页 2 2）碱变性法）碱变性法 原理：碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性原理：碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异，染色质在拓扑学上的差异，在在pH 12.0-12.6pH 1

58、2.0-12.6碱性环境碱性环境中，中，线性的大分子量细菌染色体线性的大分子量细菌染色体DNADNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNADNA仍为自然状态；仍为自然状态；将将pHpH调至中性并有高浓度盐存在的条件下调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体染色体DNADNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNADNA和蛋和蛋白质在去污剂白质在去污剂SDSSDS的作用下形成沉淀，而质粒的作用下形成沉淀，而质粒DNADNA仍为可溶仍为可溶状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体状态。通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNADNA、RNARNA及蛋白质

59、，质粒及蛋白质，质粒DNADNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒化质粒DNADNA。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。环、闭环超螺旋。 第122页/共203页第123页/共203页 试剂试剂 1. LB1. LB培养基培养基 2. 2. 溶液溶液 I I 3. 3. 溶液溶液 4. 4. 溶液溶液IIIIII 5. TE(pH8.0) 5. TE(pH8.0) 稳定稳定第124页/共203页 LBLB培养基培养基 配制配制1 1升培养基，应在升培养基，应在950ml950ml去

60、离子水中加入：去离子水中加入： 细菌培养基用胰化蛋白胨细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g(bacto-tryptone) 10g 细菌培养基用酵母提取物细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g(bacto-yeast extract) 5g NaClNaCl10g10g 摇动容器直至溶质完全溶解，摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/L NaOH(5mol/L NaOH(约约0.2ml)0.2ml)调节调节pHpH值至值至7.0,7.0,加入去离子水至总体积为加入去离子水至总体积为1L1L，15 lbf/in15 lbf/in2 2(1.