降血糖药物筛选方法

1、降血糖药物筛选方法降血糖药物筛选方法2010年年11月月5日日v导论导论v动物水平筛选动物水平筛选v细胞水平筛选细胞水平筛选v酶和受体水平筛选酶和受体水平筛选v总结和思考总结和思考糖尿病（糖尿病（DM, Diabetes Mellitus） 糖尿病为一种多病因的代谢疾病，特点糖尿病为一种多病因的代谢疾病，特点是慢性是慢性高血糖高血糖，伴随因，伴随因胰岛素分泌胰岛素分泌及及/或作用或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。指标指标：t餐后2 h 血糖高于11.1 mmol/ Lt空腹血糖高于7.0 mmol/ L 发病率发病率v全球糖尿病患者人数已超过全球糖尿

2、病患者人数已超过1.77亿亿，预计到，预计到2025年将年将达到达到3.7亿，成为继心血管和肿瘤之后第三位亿，成为继心血管和肿瘤之后第三位“健康健康杀手杀手” （WHO）。）。v中国糖尿病发病率达中国糖尿病发病率达5%，全国糖尿病患者人数已在，全国糖尿病患者人数已在3000万以上，糖尿病患者的人数仅次于印度居世界第万以上，糖尿病患者的人数仅次于印度居世界第二位。二位。世界糖尿病日世界糖尿病日 纪念胰岛素的发现者纪念胰岛素的发现者班廷班廷的诞辰，世界卫生组织的诞辰，世界卫生组织（WHO）和国际糖尿病联盟（）和国际糖尿病联盟（IDF）将班廷医生）将班廷医生的生日的生日11月月14日日定为世界糖尿病

3、日（定为世界糖尿病日（WDD）。）。班廷，班廷，Banting，加拿大生理学家加拿大生理学家（1891-1941） 控制糖尿病，刻不容缓！（Lets take control of diabetes. Now！） 糖尿病的事实糖尿病的事实v全球全球每每30秒秒就有一人因糖尿病而截肢。就有一人因糖尿病而截肢。 v每年死于糖尿病的人远远高于死于艾滋病的人。每年死于糖尿病的人远远高于死于艾滋病的人。v2005年，全球约年，全球约290万万人死于糖尿病。人死于糖尿病。 v每年患糖尿病的人数增加每年患糖尿病的人数增加700万万，而且多数集中在，而且多数集中在亚洲。亚洲。 v每每10秒秒中，就有人死于糖尿

4、病相关性疾病；同时，中，就有人死于糖尿病相关性疾病；同时，就有就有2例例新病例被诊断新病例被诊断 v在发达国家，糖尿病是成年人在发达国家，糖尿病是成年人失明失明和视力障碍的和视力障碍的主要原因。主要原因。 v2型糖尿病占糖尿病患者的型糖尿病占糖尿病患者的90以上。以上。 v肥胖是肥胖是2型糖尿病的主要危险因素。型糖尿病的主要危险因素。并发症并发症 糖尿病可导致糖尿病可导致失明失明、心脑血管疾病心脑血管疾病、肾功能衰竭肾功能衰竭、神经病变神经病变、肢体坏疽肢体坏疽以致截肢、昏迷等多种并发以致截肢、昏迷等多种并发症。症。治疗药物治疗药物v磺脲类：磺脲类： 格列本脲格列本脲（优降糖）（优降糖）格列齐

5、特格列齐特（达美康）（达美康） 格列吡嗪（美吡达）格列喹酮（糖适平格列吡嗪（美吡达）格列喹酮（糖适平 格列美脲（亚莫利）格列美脲（亚莫利）v双胍类：双胍类： 苯乙双胍（降糖灵）二甲双胍（美迪康）苯乙双胍（降糖灵）二甲双胍（美迪康） v糖苷酶抑制剂：糖苷酶抑制剂： 阿卡波糖（拜糖平）伏格列波糖（倍欣）阿卡波糖（拜糖平）伏格列波糖（倍欣） v胰岛素增敏剂：胰岛素增敏剂：罗格列酮（文迪雅）罗格列酮（文迪雅） v胰岛素：胰岛素：诺和灵、优泌林诺和灵、优泌林二、动物水平筛选二、动物水平筛选 2.1 I型糖尿病动物模型型糖尿病动物模型 造模方法：造模方法： 采用化学试剂破坏胰岛细胞造模或因为遗传因素，胰岛

6、细胞受到自身免疫性破坏而产生的。 1）化学试剂诱导的高血糖动物模型）化学试剂诱导的高血糖动物模型 链脲霉素（四氧嘧啶）诱导的高血糖动物模型链脲霉素（四氧嘧啶）诱导的高血糖动物模型 链脲霉素诱导的高血压动物模型链脲霉素诱导的高血压动物模型原理：原理： 含亚硝基的化合物t 特异性破坏胰岛细胞t 诱导NO大量合成t 激活自身免疫过程 STZ量决定细胞损伤程度： 凋亡（低剂量）凋亡（低剂量） 高剂量（坏死）高剂量（坏死）链脲霉素结构链脲霉素结构 v方法：方法：一次性大剂量静脉或腹腔注射STZ 大鼠（60-80 mg/kg） 小鼠（100-200 mg/kg）v注意：注意： STZ水溶液不稳定，生物半衰

7、期5 min，造 模时新鲜配置、快速注射。v结果：结果：注射72 小时后，血糖稳定升高，动物出现 三多症状（多食、多饮、多尿）。 v优缺点：优缺点：造模快速、模型稳定、组织毒性小；但 价格昂贵2）自发性糖尿病大鼠（）自发性糖尿病大鼠（BB大鼠） 渥太华渥太华Biobreeding实验室培育出来的自发遗传实验室培育出来的自发遗传I 型糖型糖尿病大鼠。尿病大鼠。v发病机制：发病机制：自身免疫性破坏胰腺细胞引发胰腺炎v发病特征：发病特征：于出生后60日发病，体重减轻，糖尿， 低胰岛素，胰腺炎、胰岛细胞减少， 须胰岛素治疗才能生存。 2.2 II型糖尿病动物模型型糖尿病动物模型II 型糖尿病动物模型的

8、病理生理改变型糖尿病动物模型的病理生理改变t 胰岛素抵抗增加t 基础肝糖输出率增加，空腹高血糖t 胰岛细胞功能减退 胰岛素抵抗的出现，为维持血糖稳定，胰岛细胞分泌胰岛素代偿性增加，最终导致细胞分泌功能障碍，发展为糖尿病。1）高糖高脂饮食诱发）高糖高脂饮食诱发II型糖尿病动物模型型糖尿病动物模型v方法：方法： 采用占热量61%高脂饮食（饱和脂肪酸的动物脂肪，蛋白质19%，碳水化合物20%，脂肪61%），饲养3-6周。v指标：指标： 血糖升高，胰岛素水平升高，出现明显的胰岛素抵抗。v优缺点：优缺点： 模拟人类高糖高脂膳食诱发糖尿病模型； 但造模时间较长，成本高，不稳定。2）自发性糖尿病大鼠（）自发

9、性糖尿病大鼠（PO大鼠） PO大鼠又称嗜沙肥鼠发病特征发病特征： 出生两周后，90%PO大鼠出现明显的胰岛素抵抗症状。发病阶段：发病阶段：t 起始阶段，血清及胰岛素水平正常t 胰岛素水平升高，血糖正常t 高胰岛素水平，高血糖水平t 胰岛细胞受损，导致低胰岛素和高血糖3）肥胖高血糖小鼠（）肥胖高血糖小鼠（ob/ob小小鼠）v发病特征：发病特征：体型极胖，早期有高血糖和糖尿，血清胰岛素水平高，有明显的胰岛素抗性。胰岛肥大增生，胰岛素含量增加。v用途：用途：胰岛素增敏剂的研究4）糖尿病小鼠（）糖尿病小鼠（db/db小小鼠）v发病特征：发病特征：体型极胖，脂肪沉淀，早期有高血糖和糖尿，高胰岛素血症，晚

10、期可见胰岛细胞坏死。2.3 降糖药物体内药效评价方法降糖药物体内药效评价方法v利用糖尿病动物模型评价药效，主要以利用糖尿病动物模型评价药效，主要以空腹血空腹血糖、糖耐量及胰岛素敏感性糖、糖耐量及胰岛素敏感性为指标。为指标。va）空腹血糖测定）空腹血糖测定 取材：取材：动物禁食过夜，次日眼眶采血，测 定血糖浓度。 方法：方法：葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法以及 血糖仪。葡萄糖氧化酶法（国内推荐方法）葡萄糖氧化酶法（国内推荐方法）葡萄糖葡萄糖 + O2葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶葡萄糖酸葡萄糖酸+ H2O2H2O2+ 4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉 + 酚酚过氧化物酶过氧化物酶醌亚胺醌亚胺 + H2O 醌亚

11、胺醌亚胺在在480-550 nm有最大吸收峰，醌亚胺与葡萄糖的量成有最大吸收峰，醌亚胺与葡萄糖的量成正比，正比，比色法比色法测定醌亚胺的量，即可得到葡萄糖浓度。测定醌亚胺的量，即可得到葡萄糖浓度。v原理：原理：v方法：方法：葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶过氧化物酶过氧化物酶磷酸缓冲液磷酸缓冲液酚酚4-4-氨基安替吡啉氨基安替吡啉孵育孵育15 min505 nm测定测定吸光度吸光度ODv结果：结果：v局限：局限：还原性物质如尿酸、维 C 、胆红素等，可 与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反 应过程中所产生的过氧化氢，使测定结果偏低v 举例：举例：葡萄糖浓度葡萄糖浓度 =A样品样品-A空白空白A标准标准

12、-A空白空白X 标准浓度（标准浓度（mM）样品样品OD 葡萄糖浓度（葡萄糖浓度（mM）空白0.050标准品0.955.0样品A0.5?样品B0.35? 血糖仪血糖仪v方法：方法： 手指采集1 ul血样，将试纸顶端轻靠血样，试纸就可以自动吸收血样，插入血糖仪，只需5秒快速显示测试结果v特点：特点： 方便、快速、简单，主要用于糖 尿病患者日常监控血糖，但准确 度稍差。b）糖耐量试验）糖耐量试验口服糖耐量口服糖耐量试验：试验： 糖尿病诊断主要指标，也是降糖药物药效评价糖尿病诊断主要指标，也是降糖药物药效评价的主要指标。的主要指标。原理：原理：t口服葡萄糖后，血糖迅速上升，刺激胰岛素分泌，肝糖口服葡萄

13、糖后，血糖迅速上升，刺激胰岛素分泌，肝糖元合成增加，血糖持续下降。元合成增加，血糖持续下降。t正常人服用葡萄糖正常人服用葡萄糖30-60 min，血糖达到最高峰，之后迅，血糖达到最高峰，之后迅速下降，在速下降，在2 h左右，血糖降至正常。左右，血糖降至正常。t糖尿病时，耐糖功能下降，服糖后血糖峰值超过正常，糖尿病时，耐糖功能下降，服糖后血糖峰值超过正常，且且2 h不能下降到正常不能下降到正常 。v方法：方法： 实验前动物过夜禁食，灌胃给葡萄糖或蔗糖（实验前动物过夜禁食，灌胃给葡萄糖或蔗糖（2.5g/kg），），或淀粉（或淀粉（3-5g/kg）。测定给糖后）。测定给糖后0 h，0.5 h，1 h

14、，2 h血浆血浆血糖浓度，并绘制血糖变化曲线。血糖浓度，并绘制血糖变化曲线。v结果：结果：葡萄糖耐量试验葡萄糖耐量试验050100150200250300050100150200口服葡萄糖后时间（min）葡萄糖浓度（mg/dl）sample1sample2sample3哪一个样本是哪一个样本是糖尿病鼠？哪糖尿病鼠？哪个是降糖药治个是降糖药治疗后样本？疗后样本？c) 胰岛素释放试验胰岛素释放试验v目的目的：检查胰岛功能和胰岛素分泌水平v原理：原理：I型糖尿病，空腹胰岛素水平很低； II型糖尿病，空腹胰岛素水平正常或偏高， 葡萄糖刺激后，胰岛素分泌增加； 部分药物可促进胰岛素分泌，提高胰岛素水平v

15、方法：方法：灌胃给葡萄糖或蔗糖（2.5 g/kg），或淀粉 （3-5 g/kg）.测定给糖后0 h，0.5 h，1 h，2h 血浆胰岛素浓度，并绘制胰岛素变化曲线。胰岛素测定方法（胰岛素测定方法（ELISA）：）：原理：原理：预先包被胰岛素抗体在ELISA 板上，加入样品后，样品 中的胰岛素与包被抗体结合，再加入生物素标记的抗胰 岛素单克隆抗体，结合已俘获胰岛素的另一端，最后加 入过氧化酶标记的抗生物素，生物素与抗生物素结合。 通过过氧化物酶底物显色来定量测定样品中的胰岛素。v方法：方法：胰岛素测定试剂盒（胰岛素测定试剂盒（wako）v组成：组成：抗胰岛素包被板；胰岛素标准溶液；生物素抗胰岛素

16、包被板；胰岛素标准溶液；生物素标记的抗胰岛素抗体；标记的抗胰岛素抗体；HRP 标记的链酶亲和素；显色标记的链酶亲和素；显色底物；终止液；洗涤液底物；终止液；洗涤液v 试验操作试验操作：参见试剂盒说明：参见试剂盒说明v 结果：结果：胰岛素标准曲线胰岛素标准曲线样品样品 OD胰岛素水平胰岛素水平10.85 ng/ml20.10.3 ng/ml31.58.5 ng/ml胰岛素释放试验010203040506070020406080100120140口服葡萄糖后时间（min）胰岛素浓度（ng/ml）sample 1sample 3sample 2胰岛素释放试验051015202530350204060

17、80100120140口服葡萄糖后时间（min）胰岛素浓度（ng/ml）sample1sample4图图 哪个样品为正常，哪个样品为正常，I型或型或 II型病人？型病人？图图 哪个为治疗前或治疗后？哪个为治疗前或治疗后？图图 哪个为治疗前或治疗后？哪个为治疗前或治疗后？图图胰岛素释放试验010203040506070020406080100120140口服葡萄糖后时间（min）胰岛素浓度（ng/ml）sample 2sample 5图d) 葡糖钳技术葡糖钳技术(glucose clamp technique)v葡糖钳技术葡糖钳技术是美国耶鲁大学医学院于是美国耶鲁大学医学院于1979年创立的一种

18、年创立的一种临床测定胰岛素分泌或胰岛素敏感性的定量技术。临床测定胰岛素分泌或胰岛素敏感性的定量技术。 正糖钳：正糖钳：对胰岛素的敏感性的定量分析，是国际上公认的对胰岛素的敏感性的定量分析，是国际上公认的评估胰岛素敏感性和评估胰岛素敏感性和细胞功能的细胞功能的“金标准金标准” 。v正糖钳技术原理：正糖钳技术原理： 静脉注射胰岛素使其维持高水平；静脉注射胰岛素使其维持高水平； 同时静脉注射葡萄糖使同时静脉注射葡萄糖使血糖维持在基础血糖水平上。高胰岛素水平代谢葡萄糖，血糖维持在基础血糖水平上。高胰岛素水平代谢葡萄糖，为维持血糖需不断注射葡萄糖，为维持血糖需不断注射葡萄糖，当葡萄糖注射速率平衡时，当葡

19、萄糖注射速率平衡时，此时的速率相当于体内代谢葡萄糖的速率此时的速率相当于体内代谢葡萄糖的速率。v1983发展大鼠正糖钳试验。发展大鼠正糖钳试验。Dr. Jim Liebau方法：方法：t大鼠麻醉t颈静脉插管t接三通管，两个进口端一侧输入10%葡萄糖，一侧输入胰岛素，出口端接静脉插管t手术完毕，输入4 mU/kg/min胰岛素，同时输入10%葡萄糖t 每隔10 min测定血糖t血糖输入速率至稳态后，记录连续60 min葡萄糖输注速率t 稳态下6次葡萄糖输注速率平均值为GIR， 6次血糖平均值为BG结果：结果：稳态葡萄糖注射速率GIR值 11.56 mg/kg/min 血糖平均值BG 值4.13

20、mM哪个样品胰岛素敏感度高？哪个样品是来自药物治疗后大鼠？ 02468101214161820GIRGIR（mg/kg/mi（mg/kg/min）n）sample 1sample 1sample 2sample 2胰岛素-正糖钳试验胰岛素-正糖钳试验三、细胞水平降糖药物筛选三、细胞水平降糖药物筛选 脂肪细胞（肝细胞）脂肪细胞（肝细胞）-葡萄糖消耗葡萄糖消耗 葡萄糖转运试验葡萄糖转运试验 1. 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗实验脂肪细胞葡萄糖消耗实验脂肪细脂肪细胞胞11mM葡萄糖葡萄糖含药培养液含药培养液培养培养24或或48 h检测培养液中检测培养液中葡萄糖消耗量葡萄糖消耗量葡萄糖氧葡萄糖氧化酶

21、法化酶法计算葡萄糖计算葡萄糖消耗量消耗量阳性药物可选择二甲双胍阳性药物可选择二甲双胍糖消耗量糖消耗量(mM)=11mM-培养基葡萄糖浓度培养基葡萄糖浓度(mM)2. 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运实验脂肪细胞葡萄糖转运实验脂肪细脂肪细胞胞加药加药培养培养24h0.5 uCi/ml2-deoxy-H -D-glucose3孵育孵育10min 加加NaOH裂解细胞裂解细胞细胞细胞裂解液裂解液KRP缓冲液缓冲液清洗清洗3次次H 含量含量同位素同位素测定仪测定仪KRP缓冲液组成：缓冲液组成：131.2 mM NaCl，4.7 mMKCl，2.47 mM CaCl2， 1.24 mM MgSO4, 2.

22、48 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES3 b b-细胞损伤模型细胞损伤模型nH2O2n链脲霉素n四氧嘧啶 b b-细胞胰岛素分泌模型细胞胰岛素分泌模型n b b-细胞ATP敏感钾通道阻断剂 四、分子水平降糖药物筛选四、分子水平降糖药物筛选4.1 a a-糖苷酶抑制剂筛选糖苷酶抑制剂筛选原理：原理：t 饮食中淀粉和蔗糖饮食中淀粉和蔗糖(双糖双糖)不能直接被肠壁细胞吸收，需要不能直接被肠壁细胞吸收，需要在小肠绒毛上的多种在小肠绒毛上的多种-葡糖苷酶的作用下生成单糖葡糖苷酶的作用下生成单糖(葡萄糖及葡萄糖及果糖果糖)后才能被吸收。后才能被吸收。t -糖苷酶上具有与糖苷酶上具有与寡糖及双糖相结合的位点寡糖及双糖相结合的位点，药物与这个位，药物与这个位点结合，能点结合，能可逆性地抑制可逆性地抑制小肠绒毛上的多种小肠绒毛上的多种-葡糖苷酶的活葡糖苷酶的活性。性。v-糖苷酶有多种，包括：糖苷酶有多种，包括：蔗糖酶；葡萄糖淀粉酶；麦芽糖酶；糊精酶。阿卡波糖阿卡波糖阿卡波糖与阿卡波糖与-蔗糖酶结合位点蔗糖酶结合位点方法：方法：p-NPG(底物底物)磷酸缓冲液磷酸缓冲液0.2U/ml a-糖