第四章核酸化学ppt课件

1、第四章第四章 核酸化学核酸化学 主要内容：主要内容： 主要引见碱基、核苷、核苷酸和核酸的构造、主要引见碱基、核苷、核苷酸和核酸的构造、性质和功能，核酸的分别、提纯、鉴定等。性质和功能，核酸的分别、提纯、鉴定等。核蛋白核蛋白 磷酸磷酸 核苷核苷 碱基碱基 戊糖戊糖 蛋白质蛋白质 核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚核酸是由几十个甚至几千万个核苷酸聚合而成的具有一定空间构造的大分子化合物。合而成的具有一定空间构造的大分子化合物。 核酸核酸核苷酸核苷酸 一、核酸的概念和重要性一、核酸的概念和重要性 一核酸的概念一核酸的概念 核酸英文名核酸英文名nucleic acidNA 1868年瑞士年瑞士F. M

2、iescher米歇尔发现了核酸。米歇尔发现了核酸。二核酸的重要性二核酸的重要性 二、核酸的类别、分布和组成二、核酸的类别、分布和组成 一类别一类别 nucleic acid ribonucleic acid, RNA deoxyribonucleic acid, DNA 二分布二分布 三组成三组成 1碱基碱基base：又称含氮碱：又称含氮碱 1嘧啶碱嘧啶碱pyrimidine, Py 2嘌呤碱嘌呤碱purine, Pu 其它嘌呤核酸的代谢产物：其它嘌呤核酸的代谢产物：黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸等黄嘌呤、次黄嘌呤、尿酸等 3修饰碱基修饰碱基modified base： 也称稀有碱基也称稀有碱基min

3、or base 4 4碱基的性质碱基的性质 普通的物理性质普通的物理性质 互变异构景象互变异构景象 CNNOOHHCNNOHHOuracil酮式 uracil烯醇式 碱基的紫外吸收碱基的紫外吸收 最大吸收峰在最大吸收峰在260nm附近附近 碱基的解离碱基的解离 2 2戊糖戊糖pentosepentose 1 1构造构造 OHOH2CHOHHOHOHHHOHOH2CHOHHHOHHHOHOH2CHOHHOCH3OHHH-D-核糖核糖-D-2-脱氧核糖脱氧核糖-D-2-O-甲基核糖甲基核糖2 2性质性质 氧化反响氧化反响 OCHbaseHOHOHOH2PIO4-OCHbaseHOH2PCHOOHC

4、CH3NH2H+OCNCHCHCH3baseHOH2CHHO+ H3PO4加成化合物H 碱水解碱水解 OHRNA-水解OHOH2CHHHbaseHOOPOHO2-核苷酸3-核苷酸 混合物 颜色反响颜色反响 CH3OHHOD-核糖浓HCl 绿色苔黑酚法FeCl3D-2-脱氧核糖 蓝色二苯胺法HNH+3磷酸磷酸phosphoric acid H3PO4pKa1=2H+H2PO4-pKa2=7H+2-HPO4pKa3=12H+3-PO4三、核苷、核苷酸三、核苷、核苷酸 一核苷一核苷nucleosidenucleoside 1 1核苷的构造核苷的构造 核苷：含核苷：含N N苷，苷，-苷苷 OHOH2C

5、HHHbaseHOHOH核苷中戊糖与碱基的衔接方式：核苷中戊糖与碱基的衔接方式： OHOH2CHHHHOHOHNNNNNH291 腺嘌呤核苷adenosine胞嘧啶脱氧核苷deoxycytidneOHOH2CHHHHOHHN1NONH21OCH2HHOHHOHHNNONH2HOsyn-CytidineOCH2HHOHHOHHNNNH2HOanti-CytidineOOCH2HHOHHOHHHOsyn-AdenosineNNNNNH2OCH2HHOHHOHHHOanti-AdenosineNNNNNH2核苷核苷 核糖核苷核苷：核糖核苷核苷：A、G、C、U 脱氧核糖核苷脱氧核苷：脱氧核糖核苷脱氧核

6、苷：dA、dG、dC、dT 命名，简写符号命名，简写符号 天然核苷：普通为反式构象天然核苷：普通为反式构象 2修饰核苷修饰核苷modified nucleoside： 也称稀有核苷也称稀有核苷minor nucleoside 修饰核苷包括三种情况修饰核苷包括三种情况: 1由修饰碱基和糖组成的核苷由修饰碱基和糖组成的核苷 2由非修饰碱基和由非修饰碱基和2-O-甲基核糖组成的核苷甲基核糖组成的核苷 3由碱基与糖衔接方式特殊的核苷由碱基与糖衔接方式特殊的核苷 NNNNNHCH3dRN6-Methyl-dA1HNNHO5,6-dihydrouridineORHHH(D or hU)2OCH2HHOHH

7、OCH3HHO2-O-甲基腺苷Ade(Am)NNCH3NH25-Methyl-dCOdR3OCH2HHOHHOHHHO (pseudouridine)HNNHOO51假尿嘧啶核苷()NNNNORW(Y)核苷NRH3CCH3(Wyosine)HNNNCORQ 核苷(Queuosine)RH2N 还有一些核苷，它们的碱基不是嘌呤环，但可还有一些核苷，它们的碱基不是嘌呤环，但可把它们看作是鸟苷的衍生物，如把它们看作是鸟苷的衍生物，如Y核苷、核苷、Q核苷。核苷。 修饰核苷的简写符号修饰核苷的简写符号 少数修饰核苷用单字符号如少数修饰核苷用单字符号如D、I；但大多数修饰；但大多数修饰核苷是将碱基取代基、

8、取代位置和取代数目写在核苷单字核苷是将碱基取代基、取代位置和取代数目写在核苷单字符号的左边，用小写英文字母代表取代基。符号的左边，用小写英文字母代表取代基。 m N22取代位置核苷取代基的数目取代基取代基用以下小写英文字母表示取代基用以下小写英文字母表示 :甲基甲基m 乙酰基乙酰基ac 氨基氨基n 甲硫基甲硫基ms 羟基羟基o或或h 硫基硫基s 异戊烯基异戊烯基i 羧基羧基c 例：例：HNNORSHNNOROCH2OHs4 Uom5 U或hm5 U留意：留意：例例: 2-O-甲基腺苷甲基腺苷 Am 含修饰核糖的核苷即含修饰核糖的核苷即2-O-甲基核苷的表示方法，甲基核苷的表示方法，在核苷符号的

9、右下方注上一个小写在核苷符号的右下方注上一个小写m。3核苷的性质核苷的性质 1物理性质物理性质 2互变异构景象互变异构景象 3紫外吸收：紫外吸收：OD260 4两性解离两性解离 AdeACytCGuaGpKa 4.13.634.44.13.31.6二核苷酸二核苷酸nucleotide, Nt 1核苷酸的构造核苷酸的构造 1核糖核苷酸核糖核苷酸ribonucleotide： 2，3，5一核糖核苷酸一核糖核苷酸(2-AMP)(3-AMP)(5-AMP)3，5一脱氧核糖核苷酸一脱氧核糖核苷酸Deoxyadenosine 3- monphosphate (3- dAMP)Deoxyadenosine

10、5- monphosphate (5- dAMP)2脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸deoxyribonucleotide：2 2核苷酸的性质核苷酸的性质 1普通物理性质普通物理性质 2互变异构景象互变异构景象 3紫外吸收紫外吸收 4 4种单核苷酸吸收光谱的规范比值种单核苷酸吸收光谱的规范比值 250/260 280/260 290/2602.07.02.07.02.07.05-CMP0.460.842.100.991.550.305-AMP0.850.800.220.150.030.0035-UMP0.740.730.380.400.030.035-GMP1.221.150.680.680.40

11、0.28光密度光密度 比值比值pH核苷酸核苷酸 A260：样品在：样品在260nm处的吸收值处的吸收值 E260：所测核苷酸的摩尔消光系数：所测核苷酸的摩尔消光系数 C： 核苷酸样品的浓度核苷酸样品的浓度mg/ml 核苷酸核苷酸(mg) = Mr N VA260E260核核苷苷酸酸A260E260MrC100胞嘧啶核苷酸的解离胞嘧啶核苷酸的解离 OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHOCMPpKa2=4.5-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOOCMPpKa3=6.4-pI =CMPpKa1+pKa22=0.8+4.52= 2.65OCH2HHOHHOHHONNONH2POOH

12、OCMPpKa1=0.80H+-OCH2HHOHHOHHONNONH2POOHHOCMP+H+4核苷酸的两性解离和等电点核苷酸的两性解离和等电点 4种核苷酸的解离曲线种核苷酸的解离曲线 可在可在pH2.05.0之间分别各种核苷酸之间分别各种核苷酸 pH3.5时各核苷酸所带电荷时各核苷酸所带电荷 核苷酸核苷酸 磷酸基电荷磷酸基电荷 碱基的电荷碱基的电荷 净电荷净电荷 AMP-1+0.54-0.46GMP-1+0.05-0.95CMP-1+0.84-0.16UMP-1+0-1三核苷酸的重要衍生物三核苷酸的重要衍生物 1ATP类的高能磷酸化合物类的高能磷酸化合物 AMPADPATP2环状核苷酸环状核

13、苷酸 细胞内细胞内 :ATP cAMP + PPi 磷酸二酯酶磷酸二酯酶 5-AMP 腺苷酸环化酶腺苷酸环化酶 AC 3核苷多磷酸类核苷多磷酸类 四、四、DNA的构造的构造 一一DNA的一级构造的一级构造 1DNA分子中核苷酸的衔接方式分子中核苷酸的衔接方式 RNA简写方法：线条式、文字式简写方法：线条式、文字式 2DNA分子中核苷酸的陈列顺序分子中核苷酸的陈列顺序 英国英国Sanger 1975年加减法，年加减法，1977年末端终止法年末端终止法 美国美国Maxam和和Gilbert 1977年化学断裂法年化学断裂法 1酶法双脱氧法、末端终止法酶法双脱氧法、末端终止法 2化学法化学断裂法化学

14、法化学断裂法 利用多核苷酸激酶将利用多核苷酸激酶将32P32P标志在标志在DNADNA的的55末端，末端，用特异的化学试剂修饰用特异的化学试剂修饰DNADNA分子中的不同碱基，然分子中的不同碱基，然后用特异的试剂在特异的地方断裂，产生长短不后用特异的试剂在特异的地方断裂，产生长短不同的同的DNADNA片段，再进展电泳，放射自显影，即可读片段，再进展电泳，放射自显影，即可读出出DNADNA序列。序列。二二DNA的二级构造的二级构造 1提出提出DNA双螺旋构造模型的根据双螺旋构造模型的根据 1x-光衍射分析光衍射分析 20世纪世纪40年代年代Astbury 1952年年M.Wilkins 2DNA

15、碱基组成的定量分析碱基组成的定量分析 20世纪世纪40年代年代chargaff规那么规那么 DNA碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。碱基组成有种的特异性，但没有组织、器官特异性。 A=T；G=C；A+G=T+C 2DNA双螺旋构造模型双螺旋构造模型double-helical structure 1953年年Watson和和Crick提出了提出了DNA双螺旋构造。双螺旋构造。 3碱基、糖、磷酸的位置。碱基、糖、磷酸的位置。 DNA双螺旋构造要点：双螺旋构造要点： 1两条反向平行的多核苷两条反向平行的多核苷 酸链，右手双螺旋。酸链，右手双螺旋。 4双螺旋的直径，螺距。双螺旋的直径，螺

16、距。 2 2大沟深沟大沟深沟 小沟浅沟小沟浅沟 5碱基配对碱基配对 6碱基的序列碱基的序列 稳定稳定DNA双螺旋构造的化学键双螺旋构造的化学键 1互补碱基对之间的氢键互补碱基对之间的氢键 2碱基堆积力碱基堆积力base-stacking forces 3磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间构成的离子键磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子之间构成的离子键 3DNA双螺旋的种类双螺旋的种类 Watson Crick DNA双螺旋构造双螺旋构造B型型DNA 当当DNA钠盐纤维相对湿度和盐的种类改动时，钠盐纤维相对湿度和盐的种类改动时，DNA的构象发生改动。的构象发生改动。 不同不同DNA纤维的空间构造纤

17、维的空间构造 类型类型结晶状态结晶状态ANa盐，相对湿度盐，相对湿度75%时结晶时结晶BNa盐，相对湿度盐，相对湿度92%时结晶时结晶C锂盐，相对湿度锂盐，相对湿度66%时结晶时结晶A-DNA： 与与B-DNA一样处：一样处：与与B-DNA不同点不同点 :1螺体宽而短，直径螺体宽而短，直径2.55nm；11个核苷酸一圈，螺距个核苷酸一圈，螺距2.46nm。 2碱基的倾角大一些：倾角碱基的倾角大一些：倾角19。 A-DNA：RNA分子中的双螺旋区；分子中的双螺旋区；DNA-RNA杂交分子。杂交分子。 A-DNA和和B-DNA之间可以相互转换，推测在转录时，之间可以相互转换，推测在转录时，DNA分

18、子发生分子发生BA的转变。的转变。 反向的两条多核苷酸链，右手螺旋。反向的两条多核苷酸链，右手螺旋。C型型DNA的一些数据与的一些数据与B型型DNA很类似。很类似。 C-DNA：4DNA双螺旋的研讨进展双螺旋的研讨进展 1Z-DNA 1979年美国年美国ARich等人发现了左旋等人发现了左旋DNA左手左手DNA双螺旋构造双螺旋构造晶体晶体X-光衍射分析光衍射分析 d(Cp Gp Cp Gp Cp -Gp)Z-DNA的特点的特点 Z-DNA的生物功能：的生物功能：与基因表达、基因调控有关。与基因表达、基因调控有关。 2三螺旋三螺旋DNA 3四螺旋四螺旋DNA DNA 双链线状双链线状 双链环状双

19、链环状 单链线状：动物病毒单链线状：动物病毒MVM 单链环状：噬菌体单链环状：噬菌体X174 真核细胞染色体真核细胞染色体DNA 噬菌体噬菌体T2，T5，T7，P22 E-Coli染色体染色体DNA 线粒体线粒体DNA 叶绿体叶绿体DNA 多瘤病毒多瘤病毒DNA，病毒，病毒SV40DNA 噬菌体噬菌体和和X174的复制型的复制型 三三DNA的三级构造的三级构造 噬菌体噬菌体T2DNA长约长约50m E-coli DNA 长约长约1mm 人生殖细胞人生殖细胞DNA长约长约1m 双链环状双链环状DNAdouble stranded cyclic DNA, DSCDNA : 双链环状双链环状DNA在

20、自然界是广泛存在的，如一些病毒在自然界是广泛存在的，如一些病毒DNA、一些噬菌体、一些噬菌体DNA、细菌质粒、细菌质粒DNA、线粒体和叶、线粒体和叶绿体绿体DNA等。等。 1共价闭合环状共价闭合环状DNAcovalently closed circular DNA, cccDNA的超螺旋构造的超螺旋构造superhelical structure 构成超螺旋的根底构成超螺旋的根底: DNA双螺旋的扭曲构成超螺旋双螺旋的扭曲构成超螺旋 superhelix负超螺旋负超螺旋 正超螺旋正超螺旋超螺旋超螺旋DNA的性质的性质 构造严密，粘度较低，浮力密度大，沉降速度快。构造严密，粘度较低，浮力密度大，

21、沉降速度快。变变性性2开环开环DNAopen circular DNA, ocDNA也称松环也称松环DNArelaxed circular DNA, rcDNA+3连环连环DNACatenanes DNA 单体单体二聚体二聚体四真核细胞染色体四真核细胞染色体DNA构造构造 1反复序列反复序列 repeated sequence 1高度反复序列高度反复序列highly repeated sequence 卫星卫星DNAsatellite DNA 基因组基因组genome主体主体DNAbulk DNA 卫星卫星DNAsatellite DNA 2中度反复序列中度反复序列moderately rep

22、eated sequence 3单一序列单一序列unique sequence 2 2回文构造回文构造palindromic structurepalindromic structure (1) (1) 回文构造回文构造 回文构造也称反向反复回文构造也称反向反复inverted repeats(2) (2) 发夹形和十字形发夹形和十字形五、五、RNA的构造的构造 一一RNA的类别的类别 1核糖体核糖体RNAribosomal RNA, rRNA 2转移转移RNAtransfer RNA, tRNA 3信使信使RNAmessenger RNA, mRNA 4其它类别的其它类别的RNA 1病毒病毒

23、RNAViral RNA, rRNA 2核内核内RNAnuclear RNA, nRNA 不均一核不均一核RNAheterogeneous nuclear RNA,HnRNA 小分子核小分子核RNAsmall nuclear RNA, sn RNA 小分子核仁小分子核仁RNAsmall nucleolar RNA, sno RNA 染色体染色体RNAchromosomal RNA, ch RNA 3线粒体线粒体RNAmitochondrial RNA, mit RNA 4叶绿体叶绿体RNAchloroplast RNA, chlRNA或或ctRNA 二二RNA的一级构造的一级构造 1RNA分子

24、中核苷酸之间的衔接方式分子中核苷酸之间的衔接方式3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键 2RNA分子中核苷酸的陈列顺序分子中核苷酸的陈列顺序 酵母酵母tRNAAla小片段重叠法小片段重叠法 直接阅读法直读法直接阅读法直读法 1965年3几类几类RNA的一级构造的一级构造 1 tRNA的一级构造的一级构造 tRNA一级构造的共同点一级构造的共同点: Mr较小较小Mr25000，沉降常数，沉降常数4S。 各种各种tRNA的链长很接近，普通在的链长很接近，普通在7393个核苷酸之间。个核苷酸之间。 tRNA分子中约分子中约20多个位置上的核苷酸是保守的不变和半不变的多个位置上的核苷酸是保守的不变和半不变的 各

25、种各种tRNA的的3一端为一端为CCA；5一端大多数为一端大多数为pG，少数为，少数为pC。 tRNA分子中含有较多的修饰成分。分子中含有较多的修饰成分。 2rRNA的一级构造的一级构造 原核生物核糖体原核生物核糖体 70S50S30S5S rRNA， 23S rRNA34种蛋白质种蛋白质16S rRNA21种蛋白质种蛋白质真核生物核糖体真核生物核糖体 80S60S40S5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA49种蛋白质种蛋白质18SrRNA33种蛋白质种蛋白质3mRNA的一级构造的一级构造 真核生物真核生物mRNA的一级构造可用下式表示的一级构造可用下式表示 :5 -帽子帽子 5 -

26、非密码区非密码区 密码区密码区3 -非密码区非密码区 polyA 5-cap：m7G(5)pppNmp 5-cap cap0: m7G(5)pppNp cap1: m7G(5)pppNmpNp cap2: m7G(5)pppNmpNmpNp 5-cap的功能的功能 (1) (1) 防止防止mRNAmRNA被核酸酶降解。被核酸酶降解。(2) (2) 为为mRNAmRNA翻译活性所必需。翻译活性所必需。(3) (3) 与蛋白质合成的正确起始有关。与蛋白质合成的正确起始有关。3-polyA : polyA的残基数的残基数20200个，或更多。个，或更多。polyA的功能的功能 (1) (1) 维护维

27、护mRNAmRNA，免受核酸外切酶的作用。，免受核酸外切酶的作用。(2) (2) 与翻译有关，没有与翻译有关，没有polyApolyA翻译活性降低。翻译活性降低。(3) (3) 与与mRNAmRNA从细胞核转移到细胞质有关。从细胞核转移到细胞质有关。RNA前体前体 成熟成熟RNA有功能的有功能的RNA 断裂、修剪、修饰断裂、修剪、修饰 三三RNA的二级构造的二级构造 大多数天然大多数天然RNA是一条单链，经过本身回折构成部分螺旋区，是一条单链，经过本身回折构成部分螺旋区，部分非螺旋区。部分非螺旋区。 少数病毒少数病毒RNA如水稻矮缩病毒、呼肠孤病毒、伤瘤病毒等如水稻矮缩病毒、呼肠孤病毒、伤瘤病

28、毒等RNA是双链螺旋，类似于是双链螺旋，类似于DNA的双螺旋构造。的双螺旋构造。 RNA中双螺旋构造稳定的要素主要是碱基堆中双螺旋构造稳定的要素主要是碱基堆积力，其次是氢键。积力，其次是氢键。 1tRNA的二级构造的二级构造 1aa接受臂接受臂amino acid arm 2二氢尿嘧啶环二氢尿嘧啶环 dihydrouridine loop, DHU loop 3反密码环反密码环anticodon loop 4额外环额外环extra loop 5TC环环TC loop 1980年牛心线粒体年牛心线粒体tRNAser只需只需63个核苷酸，个核苷酸，沉降常数沉降常数3S，短少，短少D环和环和D臂，呈

29、二叶草型。臂，呈二叶草型。 近年来发现近年来发现2种线虫线粒体种线虫线粒体tRNA也不是规也不是规范的三叶草构造。范的三叶草构造。 2rRNA的二级构造的二级构造 3mRNA的二级构造的二级构造 四四RNA的三级构造的三级构造 tRNA的三级构造的三级构造 六、核酸酶类六、核酸酶类包括核酸水解酶、合成酶、衔接酶等。包括核酸水解酶、合成酶、衔接酶等。 一核酸水解酶的分类一核酸水解酶的分类 1底物：核糖核酸酶底物：核糖核酸酶ribonuclease, RNase 脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease, DNase 2作用方式：核酸内切酶作用方式：核酸内切酶endonucl

30、ease3按磷酸二酯键断裂的方式按磷酸二酯键断裂的方式 4其它：如双链酶、单链酶等其它：如双链酶、单链酶等 核酸外切酶核酸外切酶exonuclease二核糖核酸酶类二核糖核酸酶类 1牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶pancreatic ribonuclease, 简称简称RNase A或或RNase I 2核糖核酸酶核糖核酸酶T1ribonuclease T1，简称，简称RNase T1 3核糖核酸酶核糖核酸酶T2ribonuclease T2，简称，简称RNase T2 主要作用点为主要作用点为Ap残基，水解速度残基，水解速度AUGC PPPPPPPAUCGAG三脱氧核糖核酸酶三脱氧核糖核酸酶

31、1牛胰脱氧核糖核酸酶牛胰脱氧核糖核酸酶 pancreatic deoxyribonuclease简称简称DNase I PPPPPPPP2牛脾脱氧核糖核酸酶牛脾脱氧核糖核酸酶 spleen deoxyribonuclease, 简称简称DNase II PPPPPPPPP3限制性内切酶限制性内切酶restriction endonuclease 简称限制酶简称限制酶 限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的限制性内切酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对本身起了维护作用。，对本身起了维护作用。发现概略发现概略: 1限制性内切酶的特征限制性内切酶的特征 具有严厉的碱基专注性，有专注的识别顺序、

32、切点具有严厉的碱基专注性，有专注的识别顺序、切点 粘性未端，平整末端粘性未端，平整末端 2限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名 ECoRI 3限制性内切酶举例限制性内切酶举例 四非专注性核酸酶类四非专注性核酸酶类nonspecific nuclease 引见二种外切酶引见二种外切酶 1蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶venom phosphodiesterase PPPOHP5-核苷酸核苷酸PPOHPPOH+蛇毒磷酸二酯酶对末端磷酸基有严厉的要求蛇毒磷酸二酯酶对末端磷酸基有严厉的要求 寡核苷酸寡核苷酸 水解速度水解速度 最快最快较慢，水解速度降低较慢，水解速度降低10倍倍最慢，几乎不作用，水解速最

33、慢，几乎不作用，水解速度再降低度再降低100倍倍 PPPOHPPPPOHHOPPPPHO橘青霉磷酸二酯酶专注性：橘青霉磷酸二酯酶专注性：与蛇毒磷酸二酯酶一样与蛇毒磷酸二酯酶一样 2牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶 对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反对末端磷酸基的要求与蛇毒磷酸二酯酶相反 PPPPHOPPHO+PPPHOP3-核苷酸核苷酸五磷酸单酯酶五磷酸单酯酶 将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，将单核苷酸或寡核苷酸末端的磷酸单酯键切开，得到磷酸和其它产物得到磷酸和其它产物 1特异性磷酸单酯酶特异性磷酸单酯酶 2非特异性磷酸单酯酶非特异性磷酸单酯酶 磷酸基无论在磷酸基无论在3或或5位，都

34、能水解，如位，都能水解，如E. Coli磷酸单酯酶磷酸单酯酶 1 磷酸基连在磷酸基连在5位才干水解，如牛精液位才干水解，如牛精液5-核苷酸酶核苷酸酶 NP2 磷酸基连在磷酸基连在3位才干水解，如麦芽位才干水解，如麦芽3一核苷酸酶一核苷酸酶 NP七、核酸的性质和最常用的研讨方法七、核酸的性质和最常用的研讨方法 一普通性质：分子大小、性状、溶解度。一普通性质：分子大小、性状、溶解度。 分子大小：分子大小：DNA Mr 1061010或更大或更大性状：性状： DNA为白色纤维状固体，而为白色纤维状固体，而RNA为白色粉末。为白色粉末。 溶解度：溶解度：DNA和和RNA均不溶于普通的有机溶剂，微溶于水

35、，均不溶于普通的有机溶剂，微溶于水， 但它们的钠盐在水中溶解度较大。但它们的钠盐在水中溶解度较大。 RNA Mr 104106或更大或更大 二粘度二粘度 三酸碱性质三酸碱性质 四紫外吸收四紫外吸收 由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有剧烈吸由于核酸中碱基的共轭双键，所以对紫外有剧烈吸收，最大吸收峰在收，最大吸收峰在260nm260nm附近，利用这一特性可进展核附近，利用这一特性可进展核酸的定量测定。酸的定量测定。 1紫外分光光度法紫外分光光度法 首先根据首先根据A260/A280的比值判别核酸样品的纯度的比值判别核酸样品的纯度纯纯DNA：A260/A280=1.8 纯纯RNA：A260/A2

36、80=2.0假设样品中含有杂蛋白或苯酚，那么假设样品中含有杂蛋白或苯酚，那么A260/A280比值明显降低比值明显降低纯的核酸样品可根据纯的核酸样品可根据260nm的光吸收值算出其含量的光吸收值算出其含量假设假设260nm光吸收值为光吸收值为1相当于相当于50g/ml双螺旋双螺旋DNA或相当于或相当于40g/ml单链单链DNA或或RNA或相当于或相当于20g/ml寡核苷酸。寡核苷酸。2摩尔磷消光系数摩尔磷消光系数molar absorptivity法法 A：样品的光吸收值：样品的光吸收值 C：每升溶液中磷的摩尔数：每升溶液中磷的摩尔数 L：光径：光径 L CA)p(8)磷的原子量(30.9每升

37、中磷的重量C( (g g) )W W LLLWA98.3098.30WACA)p( 在在pH7.0时；时；DNA的的 为为6600, RNA的的 为为77007800。 )p( )p( ：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数：摩尔磷消光系数，也称摩尔磷吸光系数 )p( 知道了磷的含量就可知核酸的含量知道了磷的含量就可知核酸的含量3增色效应与减色效应增色效应与减色效应 增色效应增色效应hyperchromic effect 减色效应减色效应hypochromic effect 五沉降特性五沉降特性 1核酸浮力密度的测定核酸浮力密度的测定 浮力密度：经密度梯度沉降平衡法测出的密度浮力密度：经密度梯度

38、沉降平衡法测出的密度 氯化绝氯化绝CsCl密度梯度沉降平衡密度梯度沉降平衡 用用12个知浮力密度的规范个知浮力密度的规范DNA样品作参考样品作参考 102022010)rr (2 . 4 式中式中 ：未知：未知DNA的密度的密度 0：规范：规范DNA的密度的密度 ：角速度弧度：角速度弧度/秒秒 r： 未知未知DNA与转轴之间的间隔与转轴之间的间隔 r0：知：知DNA与转轴之间的间隔与转轴之间的间隔 2DNA中中G-C含量的测定含量的测定 G-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系对的含量与浮力密度之间呈正比关系 Rolfe-Meselson导出了如下公式：导出了如下公式： =0.100G-C%+1

39、.658(g/cm3) 知道了浮力密度就可计算出知道了浮力密度就可计算出G-C对的含量对的含量 3核酸的构象和分别核酸的构象和分别 ：RNA环状环状DNA线状线状DNA蛋白质蛋白质 DNA 沉降沉降六核酸的变性、复性和杂交六核酸的变性、复性和杂交 1变性变性denaturation 核酸变性的概念核酸变性的概念 引起核酸变性的要素引起核酸变性的要素 1热变性热变性 构造：螺旋构造：螺旋线团线团 理化性质：紫外吸收理化性质：紫外吸收 粘度粘度比旋光度比旋光度 生物活性：生物活性生物活性：生物活性或丧失或丧失 2熔点熔点Tm Tm: 熔点，熔解温度，熔点，熔解温度， 变性温度，解链温度变性温度，解

40、链温度 3影响影响Tm值的要素值的要素 DNA的均一性的均一性 DNA中中G-C对的含量对的含量 阅历式阅历式: (G-C)%=(Tm-69.3)2.44 盐离子强度盐离子强度 2复性复性renaturation 1复性复性 理化性质理化性质: 比旋光度比旋光度 粘度粘度)p( 高于高于Tm值值5 复性复性 也称退火也称退火annealing缓缓慢慢冷冷却却迅迅速速冷冷却却生物活性得到部分恢复生物活性得到部分恢复 2影响复性的要素影响复性的要素 样品的性质样品的性质 DNA的浓度的浓度 DNA片段的大小片段的大小 温度温度 离子强度离子强度 3复性动力学复性动力学 DNA的复性过程是一种双分子

41、反响的复性过程是一种双分子反响 DSSk S：single strand DNA D：double strand DNA 2kcdtdc 经重排，积分等经重排，积分等 式中式中 C0：t=0时，起始时，起始DNA的浓度的浓度mol/L C：t时间时，单链时间时，单链DNA的浓度的浓度mol/L k：复性反响常数：复性反响常数L/molsec t：复性时间：复性时间sec CC0= 11+kC0t21CC0 Cot : 21时的时的Cot值，即指复性完成一半时的值，即指复性完成一半时的Cot值。值。 3杂交杂交hybridization 核酸的杂交：是指不同来源的单链核酸之间可经过核酸的杂交：是

42、指不同来源的单链核酸之间可经过 碱基互补构成双螺旋构造。碱基互补构成双螺旋构造。 单链单链DNA与单链与单链DNA杂交杂交DNA-DNA利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研讨同源性等。利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研讨同源性等。单链单链DNA与单链与单链RNA杂交杂交DNA-RNA单链单链RNA与单链与单链RNA杂交杂交RNA-RNA用硝酸纤维素膜作为支持物进展杂交用硝酸纤维素膜作为支持物进展杂交 1975年英国年英国E. M. Southern首创的首创的Southern blottingSouthern印迹印迹原理原理方法方法探针：作为检测用的知探针：作为检测用的知DNA序列或序列

43、或RNA序列的片段序列的片段 1977年年G.K.Stark首创首创Northern blotting Northern印迹印迹 Western blottingWestern 印迹印迹 七凝胶电泳七凝胶电泳 核酸研讨中最常用的方法核酸研讨中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、本钱低。优点：简单、快速、灵敏、本钱低。 经过凝胶电泳经过凝胶电泳 1可进展核酸分别，知道核酸的纯度。可进展核酸分别，知道核酸的纯度。 2测定分子大小。测定分子大小。 3估计核酸的构象。估计核酸的构象。 凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应 1琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳agarose ge

44、l electrophoresis 琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。核酸构象、电流等有关。 2聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis 用于分析用于分析RNA或或Mr小于小于1000bp的的DNA片段片段 适用于大分子核酸，普通用于适用于大分子核酸，普通用于DNA分析。分析。 八、核酸的生物功能八、核酸的生物功能 一一DNA的生物功能的生物功能 1DNA与遗传与遗传 1DNA是主要的遗传物质是主要的遗传物质间接证据间接证据直接证据直接证据 细菌转化

45、作用细菌转化作用 transformation 肺炎球菌肺炎球菌pneumococcus 1928年细菌学家年细菌学家Griffith 细菌毒性实验细菌毒性实验 1944年年Avery细菌转化实验细菌转化实验 转化作用：转化作用：转化作用的物质称转化因子转化作用的物质称转化因子 从一种细菌中得到从一种细菌中得到DNA经过一定途径进入另一种细菌，经过一定途径进入另一种细菌，从而引起后者遗传特性的改动。从而引起后者遗传特性的改动。 噬菌体感染实验噬菌体感染实验 1952年美国年美国Hershey 噬菌体感染实验噬菌体感染实验 转导作用转导作用transduction 人工合成基因的表达人工合成基因

46、的表达 2DNA的复制的复制replication 3DNA的转录的转录transcription 2DNA与变异与变异 突变突变 染色体畸变染色体畸变 基因突变基因突变 1基因突变基因突变genetic mutation 基因概念的开展、补充基因概念的开展、补充 什么是基因突变什么是基因突变 基因突变的几种主要方式基因突变的几种主要方式 碱基取代碱基取代base substitution，也称碱基置换，也称碱基置换 A.转换转换transition B.颠换颠换transversion 碱基缺失碱基缺失base deletion 碱基插入碱基插入base insertion 突变的缘由突变的

47、缘由 自发突变自发突变 诱发突变如紫外线、诱发突变如紫外线、X-射线、亚硝酸、烷化剂、射线、亚硝酸、烷化剂、 碱基类似物等碱基类似物等 嘧啶二聚体嘧啶二聚体 脱氨脱氨2基因重组基因重组gene recombination 基因的体外重组，即基因工程基因的体外重组，即基因工程genetic engineering 获得目的基因获得目的基因 基因载体基因载体vector 目的基因与基因载体衔接构成重组目的基因与基因载体衔接构成重组DNA 经过转化或其它方法将重组经过转化或其它方法将重组DNA分子引入受体细胞分子引入受体细胞 被转化细胞的挑选和繁衍被转化细胞的挑选和繁衍 3. DNA与遗传性疾病、癌变的关系与遗传性疾病、癌变的关系1镰刀状红细胞贫血病的镰刀状红细胞贫血病的DNA点突变点突变2白化病的基因缺失白化病的基因缺失3癌变癌变二二RNA的生物功能的生物功能 1RNA与蛋白质的生物合成与蛋白质的生物合成 1mRNA与遗传密码与遗传密码 遗传密码遗传密码genetic code 密码子密码子codon mRNA的主要功能的主要功能 2tRNA的作用的作用 tRNA的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，的作用是多方面的，它接受氨基酸、携带氨基酸，把氨基酸转运