ZTT动物细胞工程PPT学习教案

1、会计学1ZTT动物细胞工程动物细胞工程第1页/共44页动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技单克隆抗体技术术核移植核移植动动物物细细胞胞工工程程常常用用技技术术其它动物细胞工程的基础其它动物细胞工程的基础第2页/共44页本节内容：本节内容：第3页/共44页一、动物细胞培养的应用和概念：一、动物细胞培养的应用和概念：1 1、概念：、概念：动物细动物细胞培养就是从动物胞培养就是从动物有机体中取出相关有机体中取出相关的的组织组织, ,将它分散将它分散成成单个细胞单个细胞, ,然后然后, ,放在适宜的放在适宜的培养基培养基中中, ,让这些让这些细胞生细胞生长和增殖长和增殖. .2

2、、原理：、原理：细胞增殖细胞增殖第4页/共44页定义：定义：人们通常将人们通常将动物组织动物组织消化后消化后的的初次培养初次培养称为原代称为原代培养。培养。胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理取出组织取出组织胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织剪碎剪碎单个细胞单个细胞细胞悬液细胞悬液转入培养瓶内培养转入培养瓶内培养 （ 贴壁生长贴壁生长长成单层细胞长成单层细胞。有。有接触抑制接触抑制现象）现象）。原代培养原代培养3 3：过程：过程图示图示原代培养原代培养第5页/共44页强调一：细胞贴壁过程强调一：细胞贴壁过程细胞贴壁：细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散的细胞很快就在培养瓶悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁

3、上，称为细胞贴壁。贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。培养瓶或培养皿壁要求：培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易表面光滑、无毒、易于帖附。于帖附。第6页/共44页当贴壁细胞分裂生当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时长到表面相互接触时, ,细胞就会停止分裂细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为增殖，这种现象称为细胞的细胞的接触抑制接触抑制。强调二：接触抑制强调二：接触抑制第7页/共44页传代培养传代培养第8页/共44页归纳归纳过程过程取取 的组织、器官的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液 酶酶 细胞贴壁细胞贴壁、接触抑、接触抑制制 培培养养 40-50 40-50代细胞代细胞 培养培养细胞株细胞株无限传代无限

4、传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加加 液液遗传物质遗传物质 改变改变遗传物质遗传物质 改变改变动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物物胰蛋白胰蛋白培养培养原代原代传代传代未未已已原代培养特点：原代培养特点：细胞贴壁细胞贴壁、接触抑制、接触抑制第9页/共44页4.4.动物细胞培养的条件动物细胞培养的条件: :1）无菌、无）无菌、无毒的环境：毒的环境： 适宜的温度：适宜的温度：人和哺乳动物细胞最适温度人和哺乳动物细胞最适温度为为0.5。适宜的酸碱度：适宜的酸碱度：PH：4）气体环境：）气体环境：2）营养：）营养：3）温度和）温度和pH：“95“95空气空气+5+5COCO2 2” ”的混合气体培养箱。

5、的混合气体培养箱。氧氧气是细胞代谢必须的；气是细胞代谢必须的； COCO2 2维持培维持培养液的养液的PHPH。对培养液和所有培养用具对培养液和所有培养用具无菌处理；无菌处理；培养液培养液中中添加抗生素添加抗生素防止培养过程中污染；防止培养过程中污染；定期更定期更换培养液换培养液以清除代谢产物，防止对培养细胞以清除代谢产物，防止对培养细胞造成危害。造成危害。第10页/共44页问题问题3 3：为什么用胰蛋白酶处理？：为什么用胰蛋白酶处理？问题问题1 1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？胞培养材料？因为其细胞生命力旺

6、盛，分裂能力强，分化程度低。因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题问题2 2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？扩大细胞与培养液的接触面积，利于细胞吸收营养。扩大细胞与培养液的接触面积，利于细胞吸收营养。问题问题4 4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养的最适动物细胞培养的最适PH值为，胰蛋白酶作用的适宜值为，胰蛋白酶作用的适宜PH为，胃蛋为，胃蛋白酶适宜白酶适宜PH为为2.胃蛋白酶在胃蛋白酶在PH为的动物细胞培养中无活性。为的动物细胞培养中无活性。问题问题5 5：用胰蛋白酶处理不会

7、把所培养的细胞消化掉吗？：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质催化蛋白质水解。细胞间的物质主要是蛋白质( (胶原蛋白等胶原蛋白等) )。第11页/共44页问题问题6 6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？物组培培养基有何独特之处？问题问题7 7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？终培养成新个体？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维主要

8、成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：生素和动物血清等。独特之处有：1 1、液体培养基、液体培养基 2 2、成分中有动物血清等、成分中有动物血清等不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体育成新的动物个体问题问题8 8、动物细胞培养的原理：、动物细胞培养的原理： 细胞增殖。细胞增殖。问题问题9 9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在1010代代以内，为什么？以内，为什么？1010代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。代以内的细胞遗传物质不改变，保持

9、正常二倍体核型。第12页/共44页5.5.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用: :1.1.蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.2.应用于基因工程应用于基因工程 主要用于作为受体细胞主要用于作为受体细胞3.3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性检测有毒物质，判断某种物质的毒性 4.4.细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 如用于筛选抗癌药物如用于筛选抗癌药物 第13页/共44页比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的细胞的 细胞细胞培养基特有培养基特有成分成分 、植

10、物激素、植物激素 葡萄糖、葡萄糖、 培养结果培养结果植物体植物体培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得获得全能性全能性增殖增殖蔗糖蔗糖动物动物血清血清细胞株、细胞系细胞株、细胞系细胞细胞第14页/共44页二、动物体细胞核移植技术和克隆动物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：定义： 动物核移植是将动物的动物核移植是将动物的一个细胞一个细胞的细胞核的细胞核, ,移入一个已经移入一个已经去掉细胞核的卵母去掉细胞核的卵母细胞中细胞中. .使其重组并发育成一个使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎, ,这这个新的胚胎最终发育为个新的胚胎最终发育为动物个体动物个体. .

11、3、分类：分类： 胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程胚胎细胞分化程度低，恢复其全度低，恢复其全能性相对容易。能性相对容易。动物体细胞分化动物体细胞分化程度高，恢复其程度高，恢复其全能性十分困难全能性十分困难2、原理：原理： 动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性第15页/共44页4、体细胞核移植过程、体细胞核移植过程-示动物克隆示动物克隆-无性繁殖无性繁殖1.）克隆羊多）克隆羊多利培育过程：利培育过程：黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核细胞核移植细胞核移植重组细重组细胞胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎胚胎

12、移植胚胎移植另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利特别注意：特别注意：克隆动物性状克隆动物性状与供体动物完全一样吗？与供体动物完全一样吗？不可能！不可能！因为：因为：一、供体动物只提供细胞核一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（，而细胞质中的遗传物质（如线粒体如线粒体DNA）来自于受体）来自于受体卵母细胞卵母细胞.二、生物的性状不仅与遗传二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响物质有关，还受环境的影响。供体供体受体受体代孕代孕受体受体第16页/共44页黑面绵羊去黑面绵羊去核卵母细胞核卵母细胞白面绵羊乳白面绵羊乳腺细胞核腺细胞核a重组细重组细胞

13、胞电脉冲刺激电脉冲刺激早期重组胚胎早期重组胚胎b另一头绵羊的子宫另一头绵羊的子宫妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利1、写出、写出AB所代表细胞工程名称：所代表细胞工程名称：a表示：表示： b表示表示: 2、实施细胞工程时，所需、实施细胞工程时，所需受体细胞大多采用卵母细胞受体细胞大多采用卵母细胞的原因：的原因：体积大，易操作。含有促使细胞核体积大，易操作。含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。表达全能性的物质和营养条件。3 3、多利面部毛色是：、多利面部毛色是： 根据遗传学原理说明判断依据。根据遗传学原理说明判断依据。4 4、若黑面绵羊的基因型为、若黑面绵羊的基因型为AA,AA,白白

14、面绵羊的基因型为面绵羊的基因型为aaaa，则克隆羊，则克隆羊的基因型为的基因型为 核移植核移植胚胎移植胚胎移植白色白色多利全部的核基因都来自白面绵羊多利全部的核基因都来自白面绵羊aa第17页/共44页 取供体细胞传取供体细胞传代培养代培养1010代以代以内的细胞内的细胞. .为为什么？什么？用的是去用的是去核的减数核的减数第二次分第二次分裂中期细裂中期细胞（胞（M中期中期）为）为什么？什么？激活方法：激活方法：激活目的：激活目的：促融方法促融方法：电刺激：电刺激胚胎移植至代胚胎移植至代孕受体内孕受体内 妊娠、分娩妊娠、分娩2.）核移植流程）核移植流程供体：优质高产奶牛供体：优质高产奶牛受体：普

15、通奶牛（卵受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养母细胞的采集与培养） 1.体积大，易体积大，易操作。操作。2.含有含有促使细胞核表促使细胞核表达全能性的物达全能性的物质和营养条件质和营养条件。有人说它三个母有人说它三个母亲，对吗？亲，对吗？第18页/共44页核移植流程核移植流程:1、供体细胞的采集与培养、供体细胞的采集与培养5、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减、用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成减 数分裂进程。数分裂进程。6、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建、电刺激促融使供体核进入受体卵母细胞，构建 重组胚胎。重组胚胎。4、将供体细胞注入去核卵母细胞、将供体细胞注入去核卵母细

16、胞3、显微操作去除卵母细胞中的核、显微操作去除卵母细胞中的核2、受体卵母细胞的采集与体外培养、受体卵母细胞的采集与体外培养7、胚胎移植入代孕母牛体内、胚胎移植入代孕母牛体内8、妊娠分娩与供体遗传物质基本相同的犊牛。、妊娠分娩与供体遗传物质基本相同的犊牛。第19页/共44页4.体细胞核移植技术的应用前景体细胞核移植技术的应用前景第20页/共44页5.体细胞核移植技术存在的问题体细胞核移植技术存在的问题看书看书P49-50P49-50页页第21页/共44页第22页/共44页第23页/共44页一、动物细胞融合一、动物细胞融合细胞杂交：细胞杂交：不同基因型的细不同基因型的细胞之间的融合就是胞之间的融合

17、就是细胞杂交细胞杂交。杂交细胞：杂交细胞：融合后形成的具融合后形成的具有原来有原来两个或多个细胞遗传两个或多个细胞遗传信息信息的的单核细胞单核细胞成为杂交细成为杂交细胞胞。第24页/共44页 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用第25页/共44页第26页/共44页病毒颗粒黏病毒颗粒黏 附细胞表面附细胞表面细胞膜连接细胞膜连接细胞膜被细胞膜被 病毒颗粒穿通病毒颗粒穿通细胞融合、形成杂种细胞细胞融合、形成杂种细胞第27页/共44页第28页/共44页 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分

18、子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。第29页/共44页的细胞群来产生单一类型的抗体呢？的细胞群来产生单一类型的抗体呢？B B淋巴细胞在体外不能无限增殖。淋巴细胞在体外不能无限增殖。二：动物细胞融合的成功应用二：动物细胞融合的成功应用 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备思思考考第30页/共44页第31页/共44页提取提取用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基第32页/共44页1、单抗的制备过程要点：、单抗的制备过程要点：第33页/共44页4 4）、如何进行第）、如何进行

19、第2 2次筛选？次筛选？培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。第第1 1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2 2次筛选得次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。问题强化：问题强化：1 1）、本过程利用了哪些原理？）、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B B细胞融合细胞融合？ 这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物这样融合成的杂交瘤细胞，继承了

20、双亲细胞的遗传物质，不仅具有质，不仅具有B B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体第34页/共44页 特异性强，灵敏度高，可大量制备。特异性强，灵敏度高，可大量制备。3 3、单克隆抗体的应用、单克隆抗体的应用第35页/共44页第36页/共44页第37页/共44页第38页/共44页B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案伤风杆菌单克隆抗体的实验方案2、该方案能达到预期效果吗？为什么？、该方案能达到预期效果吗？为什么？4、图中、图中B为为_过程，常用过程，常用_作为诱导剂，该细胞继作为诱导剂，该细胞继承承_的遗传特性，既能的遗传特性，既能_,又能又能_。1、该实验方案的目的是、该实验方案的目