hxj血清清球蛋白分离新学习教案

1、会计学1hxj血清清球蛋白分离新血清清球蛋白分离新第一页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期2实验目的1实验原理2实验材料3实验过程45注意事项第1页/共27页第二页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期3第2页/共27页第三页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期4第3页/共27页第四页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期5 蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质常用的纯化方法常用的纯化方法分子质量分子质量透析、超滤透析、超滤凝胶层析凝胶层析离心离心溶解度溶解度调整调整pH调整离子强度调整离子强度降低介电常数降

2、低介电常数电荷电荷电泳电泳等电聚焦等电聚焦离子交换层析离子交换层析特异结合部位特异结合部位亲和层析亲和层析其他性质其他性质吸附层析吸附层析液相层析液相层析气相层析气相层析第4页/共27页第五页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期6球球 蛋蛋 白白 1 2 等电点等电点4.885.065.065.126.857.3相对分子量相对分子量（104）6.9203091515.630含量（）含量（）576725496.2121220血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白 A第5页/共27页第六页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期7血清清蛋白球蛋白半饱和硫酸铵清蛋白不沉

3、淀，上清球蛋白沉淀，蒸馏水溶解第6页/共27页第七页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期8第7页/共27页第八页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期9凝胶层析分离示意图第8页/共27页第九页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期10凝胶层析分离化合物示意图第9页/共27页第十页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期11R-SO3-H+ + Pr+R-SO3-Pr+ + H+阳离子交换阴离子交换R-N+R3OH- + Pr -R-N+R3Pr - + OH-第10页/共27页第十一页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期120.06

4、mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白pI 4.9，带负电荷多、球蛋白pI 5.05.2，带负电荷少、球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白及、球蛋白的pI6.5 ，带负电荷球蛋白pI 6.5，带正电荷清蛋白及、球蛋白被层析柱吸附,-球蛋白被洗脱0.3mol/LNH4Ac pH6.5DEAE带正电荷缓冲液离子强度增加清蛋白被洗脱第11页/共27页第十二页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期13第12页/共27页第十三页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期14血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果血清蛋白醋酸纤维

5、素薄膜电泳结果第13页/共27页第十四页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期15第14页/共27页第十五页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期16第15页/共27页第十六页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期17用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 取血清，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min沉淀（含球蛋白）加水 溶解上清液（含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白）约用4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 凝 胶 柱 层 析 除 盐继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)

6、洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12d此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性继续用0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤约2mlBaCl2检测SO42-阴性用23ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.07cm）过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.07cm）继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液12d此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性继续用0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤约2mlBaCl2检测SO42-阴性用23ml 0.02m

7、ol/L NH4AC缓冲液再生平衡盐析操作流程离子交换柱层析纯化加样加样第16页/共27页第十七页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期18用1ml 0.0mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 离 子 交 换 柱 层 纯 化除盐后收集的清蛋白用4AC缓冲液清洗层析柱内壁, 取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约2ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的洗脱液每管10d，连续收集3管DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白除盐后收集的球蛋白过DEAE-纤维素层析柱（1.06cm

8、）过DEAE-纤维素层析柱（1.06cm）用约mL 0.06mol/L NH4AC缓冲液流洗，除去球蛋白和球蛋白用0.3mol/L NH4AC缓冲液(约3ml)洗脱，流出液量约2.5ml磺基水杨酸检测蛋白质收集含有清蛋白的洗脱液每管10d，连续收集2管DEAE-纤维素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液流洗再生平衡离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定2管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法)第17页/共27页第十八页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期19第18页/共27页第十九页，编辑于星期

9、六：十四点 十九分。2009年秋季学期20第19页/共27页第二十页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期218cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）小组标记样品标记第20页/共27页第二十一页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期22薄膜粗面向下点样端置阴极端两端紧贴在滤纸盐桥上，注意：切勿使点样处与电泳槽接触电压：110V时间：50min。第21页/共27页第二十二页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期23第22页/共27页第二十三页，编辑于星期六：十四点 十九分。2009年秋季学期24第23页/共27页第二十四页，编辑于星期六：十四点 十九分。2010年秋季