引物设计原则最全汇总

1、引物设计原则（汇总）普通引物设计（适用于从载体上扩增模板）：1 .普通引物长度一般在20-30bp之间，常用24-28bp左右以保证基因特异性；2 .下载基因序列到VectorNTI;3.找到所需安装载体序列；4.将基因序列的CDS高亮标记；5 .寻找载体序列中常用酶切位点，一般为EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等等，比对检测基因序列中是否有这些位点，有的话舍弃，最后选择两个酶切位点，最好离得远一点，并且最好buffer用一样的。酶切位点一般是6bp的回文序列；6 .从基因ATG开始往后选择10-20bp均可（我的习惯是27bp-6bp酶切位点-2bp保护碱基-xbp补齐序列）

2、，但最好保证最后两个是G或者C,以减少错配率；7 .将上游酶切位点序列补在ATG前方，并根据载体对框情况补足两者之间的空缺，再根据序列的GC含量和TM值在酶切位点前补足保护碱基，以保证GC和AT的含量不能过高。注意，所有的补齐不能用到终止密码子；8 .检测上游序列的结构情况，理论上不要太多二级结构以及3'端匹配即可；不过重复的序列也不能太多，以免移码；9 .从下游终止密码子开始向前选择10-20bp均可，但最好保证最后两个是G或者C,以减少错配率；10 .选择complementarysequence,在N端补齐下游酶切位点，如果tag在C端（即下游），则在第9点中应该从终止密码子前开

3、始选择（即舍弃终止密码子），并且下游引物也要对框，如果tag在N端，则下游引物不需要对框，只要在N端加上下游酶切位点，再根据情况加上2个保护碱基，然后检测二级结构，原则上3'端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码；11 .将设计好的上下游引物放在一起检测二级结构，原则上3'端部匹配即可。不过重复的序列也不能太多，以免移码；12 .最后在NCBI的primerBlast网站上比对引物序列，看是否基因特异性的。2011年10月18日左洁1 .引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74C,不适于TaqDNAK合酶

4、进行反应。2 .引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3'端出现3个以上的连续碱基，如GGG£CCC也会使错误引发机率增加。3 .引物3'端的末位碱基对Taq酶的DN给成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR5应失败。5'端序列对PCF®响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4 .引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于

5、引发反应。上下游引物的G*量不能相差太大。5 .引物所对应模板位置序列的Tm值在72c左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,在Oligo软件中使用的是最邻近法（thenearestneighbormethod）。6 .AG值是指DN/W链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端AG值较低（绝又t值不超过9）,而5'端和中间AG值相对较高的引物。引物的3'端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DN咪合反应。7 .引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产

6、生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PC阪应不能正常进行。8 .对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。要设计引物首先要找到DNAff列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度一般在1530碱基之间。G+*量在40%60无间。碱基

7、要随机分布。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物5'端可以修饰。引物3'端不可修饰。引物3'端要避开密码子的第3位。1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%£有连续8个互补碱基同源。2 .避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNAC级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA勺稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-

8、脱氧GTPtdGTP寸扩增的成功是有帮助的。3 .长度寡核甘酸引物长度为1530bp,一月殳为2027mes引物的有效长度：Ln=2（G+C+（A+T）,Ln值不能大于38,因为38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74C）,不能保证产物的特异性。4 .G+C含量G+C含量一般为40%60%其Tm值是寡核甘酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%S核甘酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510Co若按公式Tm=4（G+C+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580C,其Tm值最好接近72c以使复性条件最佳。5 .碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好

9、是随机的，不要有聚喋吟或聚喀噬的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6 .引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3'端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8.引物的3'端引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。3'端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCRAS-PCR

10、反应中，引物3'端不能发生错配。在标准PCR5应体系中，用2UTaqDN咪合酶和800mol/LdNTP（四种dNTP各200仙mol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95C,25s；55C,25s；72C,1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3'端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A：A错配使产量下降至1/20,A：G和C：C错七下降至1/100。引物A:模板G与引物G模板A错配对PCF®响是等同的。9.引物的5'端引物的5'端限定着PCFT物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5

11、9;端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3将；引入蛋白质结合DNAff列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。Hairpin发卡结构如果自由能值大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0则该结构可以干扰反应二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向。引物之间形成如果配对区域在3末端问题会更为严重3末端配对很容易引起引物二聚体扩增使PairRating匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下TM氐的引物决

12、定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始11引物的长度以15-30bp为宜，否则会影响扩增的特异性。2碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的G+输量在40%60%之间，若G+若量太低,可在5"端加上一些G或C,若G+C含量太高，可在5"端加上一些A或T。【3】应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的3"端互补形成引物二聚体，避免在引物的3"端有3个G或3个C成串排列，3"端的末位碱基最好选T、C、G,而不选A,也有建议在引物的两端用12个喋吟碱基。4尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5C）,

13、退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。Tm值可以根据Tm=4（G+C）+2（A+T计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCFSI物设计软件大多数都采用这种方式。（注：对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的附加序列是不与模板链结合的，而在后来的PCFK应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。）【5】引物的3'端要与模板严格配对，而5'端碱基没有严格的限制，只要与模板DN阁合的部分足够长，其5'端碱基可不与模

14、板DNA!己对而呈游离状态，这样，我们可以在引物的5末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。【6】不要在扩增序列的二级结构区设计引物，以免退火困难。也要考虑引物设计处模板的特异性。引物设计原则1 .引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74C,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2 .引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3'端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3'端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。3

15、.引物3'端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3'端使用碱基Ao另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4 .引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5 .引物所对应模板位置序列的Tm值在72c左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(

16、thenearestneighbormethod)6 .是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3'端AG值较低(绝对值不超过9),而5'端和中间AG值相对较高的引物。引物的3'端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。7 .引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8 .对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。引物序列应该都是写成5-3方向的，Tm之间

17、的差异最好控制在1度之内，另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度一般在1530碱基之间。G+C含量在40%60%之间。碱基要随机分布。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物5端可以修饰。引物3端不可修饰。引物3端要避开密码子的第3位。1 .引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续

18、8个互补碱基同源。2 .避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能(G°)小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza2-脱氧GTP取彳tdGTP对扩增的成功是有帮助的。3 .长度寡核甘酸引物长度为1530bp,一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=2(G+C)+(A+T),Ln值不能大于38,因为38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74C),不能保证产物的

19、特异性。4 .G+C含量G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核甘酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核甘酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55-80C,其Tm值最好接近72c以使复性条件最佳。5 .碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚喋吟或聚喀噬的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。6 .引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的

20、复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7 .引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8 .引物的3端引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3'端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800仙mol/LdNTP（四种dNTP各200仙mol/D以质粒（103拷贝）为模板，按95C,25s；55C,25s；72C,1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3端错

21、配对扩增产物的影响是有一定规律的。A：A错配使产量下降至1/20,A：G和C：C错七下降至1/1000引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。9.引物的5端引物的5'端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。Hairpin发卡结构如果自由能值

22、大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0则该结构可以干扰反应二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向。引物之间形成如果配对区域在3末端问题会更为严重3末端配对很容易引起引物二聚体扩增使PairRating匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造成错误的起始11引物的长度以15-30bp为宜，否则会影响扩增的特异性。2碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的G+C含量在40%60%之间，若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C,若G+C含量太高，可在5'端加上一些A或T

23、。【3】应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的3'端互补形成引物二聚体，避免在引物的3'端有3个G或3个C成串排列，3'端的末位碱基最好选T、C、G,而不选A,也有建议在引物的两端用12个喋吟碱基。4尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5C）,退火温度根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。Tm值可以根据Tm=4（G+C）+2（A+T）计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。（注：对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉

24、得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的附加序列是不与模板链结合的，而在后来的PCR反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。）【5】引物的3'端要与模板严格配对，而5'端碱基没有严格的限制，只要与模板DNA结合的部分足够长，其5'端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态，这样，我们可以在引物的5末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。【6】不要在扩增序列的二级结构区设计引物，以免退火困难。也要考虑引物设计处模板的特异性。PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核甘酸片段，使其能有效地

25、扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为1530碱基，扩增片段长度为100600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中GC含量一般为40%60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚喋吟或聚喀呢存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。引物确

26、定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3'端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3端开始的。这里还需提醒的是3'端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则:引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度一般在1530碱基之间。GC含量在40%60%问。碱基要随机分布。引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物5'端可以修饰。引物3'

27、端不可修饰。引物3'端要避开密码子的第3位。PCR引物设计的目的是找到一对合适的核甘酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。1 .引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2 .避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G0）小于58.6lkJ

28、/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza2'-脱氧GTP取彳tdGTP对扩增的成功是有帮助的。3 .长度寡核甘酸引物长度为1530bp,一般为2027mer。引物的有效长度：Ln=2（GC）（AT,Ln值不能大于38,因为38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74C）,不能保证产物的特异性。4 .GC含量GC含量一般为40%60%。其Tm值是寡核甘酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核甘酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值510c若按公式Tm=4(GC)2(AT)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为5580C,其Tm值最好

29、接近72C以使复性条件最佳。5 .碱基础随机分布引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚喋吟或聚喀呢的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。6 .引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。7 .引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3'端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。8 .引物的3端引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。3端也不

30、能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中，引物3'端不能发生错配。在标准PCR反应体系中，用2UTaqDNA聚合酶和800mol/LdNTP(四种dNTP各200仙mol/D以质粒(103拷贝)为模板，按95C,25s；55C,25s；72C,1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下，引物3端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A:A错配使产量下降至1/20,A：G和C：C错七下降至1/1000引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。9 .引物的5端引物的5'端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而

31、不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10 .密码子的简并如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法引物设计重点考虑因素、设计技巧及引物设计软件推荐urbest发表于2007-07-1416:35我最近合成了几十对引物，在实战中多多少少有些心得，拿出来给大家分享。我感觉想把引

32、物合成的比较好，除了前引物和后引物的Tm不能相差太大，我们还要重点考虑以下因素：一、GC%GC含量对于PCR反应来说GC含量在40%60%,一般50%左右比较合适；而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%。产物中GC含量最好大于引物中的GC含量。二、Degeneracy多义性当设计多义引物时应尽量减少引物多义性，这样会带来更好的特异性，应尽量避免3末端的多义性，因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸。三、3'EndStability3末端稳定性引物稳定性影响它的错配效率，一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5末端和相对稳定性较弱的3末端。如果引物3稳定性强，有可能在即使5

33、末端不配对的情况下造成错配，形成非特异性扩增条带(secondarybands)。而3末端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时，由于3末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸。四、GCClampGC钳引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5末端。这一段有较强稳定性的5末端称为GC钳。它保证引物与模板的稳定结合。选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。五、SecondaryStructures二级结构二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成

34、发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。六、Hairpin发卡结构发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应，仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0则该结构可以干扰反应。七、Dimer二聚体引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形

35、成，如果配对区域在3末端问题会更为严重，3末端配对很容易引起引物二聚体扩增。八、FalsePriming错配如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布(smear)。3末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对，在使用引物设计软件时，您可以分别设定确认为错配的3末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。顺便说一下，如果是新手，刚开始接触引物设计，推荐使用PrimerPremier5.0,因为它界面简单，易学易用；如果你想把引物设计得尽善尽美，公认的首选软件是Oligo,其次我认为是DNAstar。Oligo功能强大，所以使用起来

36、就没有PrimerPremier5.0那么简便。先用PrimerPremier5.0设计，然后把设计好的引物拿到Oligo里去检测这对引物的优劣，我想这对大多数引物设计者是一个不错的选择！本实验心得来自丁香园论坛，查看原帖分享到网友评论补充一：具体说一下引物中GC含量问题引物的GC含量一般为40-60%,以45-55%为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5'端增加As或Ts；而

37、如果A-T比例过高，则同样在5'端增加Gs或Cs。但也有认为：原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250bp,含有70%AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。发表于2014-12-18您无权限看这个帖子，您的积分需要大于5如何获得积分?发表于2014-12-18补充二：b关于自由能问题（如何根据自由能判断引物质量）/b1、AG值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的AG值最好

38、呈正弦曲线形状，即5'端和中间AG值较高，而3'端AG值相对较低，且不要超过9（AG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。3'末端双链的AG是02kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在-6时只有40%、到8时少于20%、而10时接近于0。2、引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5,否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3'端的连续GGG或CCC会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其