《血红蛋白的提取和分离》导学案

1、1/6课题课题 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离【课题目标】【课题目标】1.1.通过进行探究实验，结合观看实验视频，能够尝试从血液中提取和分离血红蛋白2.2.通过阅读资料，结合教师讲解，能够了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理【课题重点与难点】【课题重点与难点】课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。【导学诱思】【导学诱思】思考 1 1：分离生物大分子的基本思路是什么？思考 2 2：蛋白质的分离和提取的原理是什么？思考 3 3：高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？思考 4 4：人们用鸡的红细胞提

2、取 DNADNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？一、基础知识：一、基础知识：（一）凝胶色谱法（分配色谱法）：（一）凝胶色谱法（分配色谱法）：1 1、概念：根据被分离蛋白质的，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。2 2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程，移动速度，而的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在移动，路程，移动速度，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3 3、具体过程：2/6A.A. 的蛋白质由于作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。B.B. （1 1）混合物上柱；（2 2

3、）洗脱开始，的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；的蛋白质被排阻于凝胶颗粒之外；（3 3）的蛋白质被滞留；的蛋白质被向下移动。（4 4）不同的蛋白质分子完全分开；（5 5）的蛋白质行程较短，已从中洗脱出来,的蛋白质还在行进中。（二）缓冲溶液：（二）缓冲溶液：1 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PHPH 发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。2 2、作用：能够抵制的对溶液的的影响，维持 PHPH 基本不变。3 3、缓冲溶液的配制通常由种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的就可以制得使用的缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲对？思考：在血红蛋白

4、整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？三）电泳：三）电泳：带电性质、分子大小和形加样待分离状的屬使分子迁移速3/6凝胶电泳原理示意图1 1、概念：指发生迁移的过程。2 2、原理：许多重要的生物大分子，如等都具有,在下，这些基团会带上。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其移动。电泳利用了待分离样品中各种分子以及分子本身、的不同使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。3 3、分类：-电泳电泳。测定测定（蛋白质相对分子质量蛋白质相对分子质量）通常用十二烷基硫酸钠通常用十二烷基硫酸钠（SDSSDS）聚丙稀酰胺凝聚丙稀酰胺凝胶电泳胶电泳蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静

5、电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入。SDSSDS 能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在 SDSSDS 的作用下会解聚成单条肽链， 因此测定的结果只是。 SDSSDS 能与各种蛋白质形成蛋白质一 SDSSDS 复合物，SDSSDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于。二、实验操作二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度纯度鉴定鉴定1.1.样品处理样品处理（1 1）红细胞的洗涤1目的：去除2方法：离心（速度越高和时间越长会使白

6、细胞4/6和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的，将下层的红细胞液体倒入再加入用的质量分数为 0.90.9%的氯化钠溶液洗涤3低速离心（低速短时间）4重复 4 4、5 5 步骤次，直至上清液中已没有，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。（2 2）血红蛋白的释放加到体积，再加 4040%体积的溶解细胞膜，置于上充分搅拌 1010分钟（加速细胞破裂），细胞破裂释放出血红蛋白. .（3 3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min2000r/min的速度离心 1010minmin，试管中的溶液分为 4 4 层：第 1

7、 1 层（最上层）：甲苯层第 2 2 层（中上层）：的沉淀层，色薄层固体第 3 3 层（中下层）：的水溶液层，的液体第 4 4 层（最下层）：其它杂质的沉淀层（4 4）透析2.2.凝胶色谱制作凝胶色谱制作1 1）凝胶色谱柱的制作1取长 4040 厘米，内径 1.61.6 厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。2底塞的制作：打孔 f 挖出凹穴 f 安装移液管头部 f 覆盖尼龙网，再用 10100 0目尼龙纱包好。a a、选择合适的橡皮塞，中间打孔；b b、在橡皮塞顶部切出锅底状的，在 0.5ml0.5ml 的头部切下长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。C.C._ 剪尼龙网小圆片覆盖

8、在上，用的尼龙纱将橡皮塞包好，插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做，连接一细的，并用螺旋夹控制尼龙管的，另一端放入收集的收集器内。5/63顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞。4组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。5安装其他附属结构。2 2）凝胶色谱柱填料的处理（1 1）凝胶的选择：。（2 2）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于中充分溶胀后，配成。（3 3）凝胶色谱柱的装填方法1固定：将色谱柱处置固定在支架上2装填：将一次性的缓慢倒入内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。3洗涤平衡装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在高的操作压下，用 300ml300ml 的

9、20mmol/L20mmol/L 的磷酸缓冲液（pHpH 为 7.07.0）充分 1212 小时。3 3）样品加入与洗脱（1 1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的缓慢下降到与平齐，关闭出口。（2 2）加透析样品1调整缓冲液面：与凝胶面平齐2滴加透析样品：用将 1ml1ml 的样品加到色谱柱的3样品渗入凝胶床：4洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱5收集：待接近色谱柱底端时，用试管收集流出液,每收集一试管连续收集。思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？思考：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分

10、离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋6/6白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（）。3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳判断的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度电泳方法步骤电泳方法步骤1 1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2 2）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶制备3 3）样品处理：4 4）把凝胶固定于电泳装置上5 5）加样：按顺序加样，加样量通常为 101025吐