液相阻断ELISA检测方法

1、一、亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断ELISA试验操作方法一、试验器材准备1. 移液器：5-50M移液器、0.210M移液器、50200M移液器、50300M12道移液器各一把。2. 移液枪尖（若干）。3. 抗原抗体反应板：微量血凝板（U型、V型均可）5块，本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注：抗原抗体反应板可重复使用,实验后，用水冲洗干净，然后用无离子水沸水浴30秒，晾干，待用。4. 超纯水，无离子水或蒸馏水。二、试剂准备1包被缓冲液（PH9.6）将所购试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开，将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4T存放,1月内有效。2. 洗涤液（PB

2、ST）将试剂盒配备的25倍浓缩PBST液（可能有结晶形成,用时微热溶化）用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。（如果PH降低,务必用NaOH调至7.4）3. 底物溶液取1片柠檬酸一磷酸盐片剂（试剂盒配备）溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液，再加1片邻苯二胺（OPD）片剂，充分溶解，分装（5mL/瓶或10Ml/瓶）,避光之-20°C保存。用前避光溶化，临时每1mL上述溶液加10卩L本试剂盒配备的3%的双氧水（H2°2）。三、操作步骤1. 用包被缓冲液稀释亚洲1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓（1：1000）,在ELISA板上每孔加50,振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。图

3、196孔酶标板检测10份样品布局图S11:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:161：641:81:321：1281:641：2561:1281：5121:2561:10241:5121:20481:10241:4096图1为抗体滴度测定（定量）检测10份样品布局图;图2为抗体滴度测定（定量）检测20份样品布局图。2. 抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作图296孔酶标板检测20份样品布局图S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:

4、2561:256S11:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以图1为例，在U型血凝板上按50M/孔量用PBST将待检血清从1:4开始做2倍连续稀释至1:512。同时，按图示稀释阴阳性对照血清，然后每孔加入50卩l用PBST稀释到使用浓度的亚I洲型口蹄疫病毒抗原（1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST）,病毒抗原对照孔加100M。振荡混匀，封板,4°C过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。3用洗涤液（1XPBST）洗ELISA板5次，在洗水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从

5、抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔，每孔50封板,37°C温育1小时。4同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000）,每孔加50M,封板,37°C温育1小时。5. 同上洗板5次，甩干。用1XPBST稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度（1:500）,每孔加50M封板,37C温育1小时。6. 同上洗板5次,每孔加50M底物溶液（务必加双氧水）,37C温育15分钟。每孔再加50M终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值（OD492492nm值）。四、结果判定1. 试验认可标准每块板设4孔病毒抗原对照，病毒

6、抗原对照不加任何血清，直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50M/孔，病毒抗原对照OD492nm值应在1.5±0.5范围内。阳性对照抗体效价应在1：1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应V1:8。2. 病毒抗原对照平均OD492nm值50%计算（临界值）抗原对照是4孔，弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照0D492nm值。3. 结果判定以病毒抗原对照平均OD492nm值的50%为临界值，被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于或等于临界值的孔为阳性孔，阳性孔的0D492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均0D492nm值为1.2,则其50%为0.60。若某一待检血清在1:128时0D492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为1:128。若临界值处于两个滴度之间,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中，两个重复孔只要有一孔为阳性孔,则抗体滴度判定为1:128,两孔均为阳性孔，则判定为抗体滴度1:1