第7章蛋白质分离纯化与表征

1、一种蛋白质的混合物在pH6的DEAE-纤维素柱中被分离，用pH6稀盐缓冲液可以洗脱C，用pH6的高盐缓冲液，B和A依次被洗脱，用凝胶过滤测定得A的Mr 是240000，B的Mr是120000，C的Mr是60000。但SDS-PAGE只发现一条带。请分析实验结果 DEAE-纤维素柱层析的结果说明，在pH6的条件下，A带有较多的负电荷，B次之，C带负电荷最少。凝胶过滤法测出A的Mr是C的4倍，B的Mr是C的2倍，但SDS-PAGE只发现一条带。由于SDS-PAGE测定的亚基的Mr，凝胶过滤法可以测定寡聚体的Mr，可以推断C是单体，B是以C为亚基的二聚体，A是以C 为亚基的4聚体，由于C在pH6时带

2、负电荷，随着亚基数的增加，带负电荷的量也会增加，这与DEAE-纤维素层析的结果也是一致的。 蛋白质分离纯化是利用其特性的差异蛋白质分离纯化是利用其特性的差异 分子的大小和形状分子的大小和形状 酸碱性质酸碱性质 溶解度溶解度 吸附性质吸附性质 对配体分子的特异生物学亲和力对配体分子的特异生物学亲和力蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求，蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求，制订分离纯化的合理程序。制订分离纯化的合理程序。 蛋白质蛋白质含有酸含有酸/ /碱碱AAAA残基残基具有两性具有两性 碱碱/ /酸酸越大越大pIpI 越大越大 pI通常在通常在 6.0 左右左右一、蛋白质的

3、酸碱性质 蛋白质的分子量蛋白质的分子量 一般在一万至一百万一般在一万至一百万道尔顿道尔顿之间之间 1道尔顿道尔顿1C12绝对质量绝对质量/12 1.6610-27千克千克二、蛋白质分子的大小与形状二、蛋白质分子的大小与形状测定蛋白质相对分子质量的原理和方法测定蛋白质相对分子质量的原理和方法（一）（一） 根据化学组成测定最低相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量（二）（二） 沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量（三）（三） 凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量（四）（四） SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量量（

4、一）根据化学组成测定最小分子量（一）根据化学组成测定最小分子量1 1、测定蛋白质中某一微量元素的含量、测定蛋白质中某一微量元素的含量2 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子、假设蛋白质中仅含一个铁原子最低相对分子质量最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量铁的百分含量例如肌红蛋白含铁量为例如肌红蛋白含铁量为0.335%，那么其最低相对，那么其最低相对分子质量就是分子质量就是55.8/0.335 100 = 16700（二）（二）沉降分析法沉降分析法 蛋白质分子在溶液中受到强大的离心蛋白质分子在溶液中受到强大的离心作用时，由于比重的关系，蛋白质分子作用时，由于比重的关系，蛋白质分子就会沉降

5、，这就是蛋白质的沉降作用。就会沉降，这就是蛋白质的沉降作用。 沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，因此利用沉降速率来测定蛋白质的相对分子质量。沉降系数：沉降系数：把物质在单位（厘米）离心场的沉降速率称沉降系数（把物质在单位（厘米）离心场的沉降速率称沉降系数（S）（三）凝胶过滤法测定相对分子质量（三）凝胶过滤法测定相对分子质量蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不取决于分子的质量，而是它的斯托克半经。如果某种蛋白质与一理想的非水化球体过柱速度相同，则认为具有与该球体相同的半径，称斯托克半径蛋白质混合样蛋白质混合样w 标准蛋白质（已知标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测和斯托克半径）和待测蛋白质必须

6、具有相同的分子形状（接近球形）蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球形）LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关：量有关： LogM LogM Ve VeVe洗脱体积，自样品开始洗洗脱体积，自样品开始洗脱到该组分的洗脱峰（峰顶）脱到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。出现时所流出的体积。先测得几种标准蛋白质的先测得几种标准蛋白质的VeVe，并以其分子量对数对，并以其分子量对数对VeVe作图得一直线，再测出作图得一直线，再测出待测样品的待测样品的VeVe，查标准曲，查标准曲线即可确定

7、分子量。线即可确定分子量。葡葡聚糖凝胶过滤法聚糖凝胶过滤法（四）（四）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法（最常用）（最常用）蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于：它的迁移率取决于：w所带电荷所带电荷w分子量分子量w分子形状分子形状但是如果在该系统中添加SDS和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量。 SDSSDS（十二烷基硫酸钠）一种阴离子去污剂，（十二烷基硫酸钠）一种阴离子去污剂，作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键。作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键。 目前测定亚基分子量的最好办法。目前测定亚基分子

8、量的最好办法。蛋白质电泳实验技术郭尧君编著蛋白质电泳实验技术郭尧君编著 科学出版社科学出版社SDSboiling均勻带上一层负电荷所有的SDS-蛋白质复合体有相同的荷质比亚基构象改变，SDS-蛋白质复合体为棒状由于不同的由于不同的SDS-蛋白质复合体具蛋白质复合体具有相同的荷质比和相同的构象，有相同的荷质比和相同的构象，因此因此迁移率不受原有的电荷、分子形状的迁移率不受原有的电荷、分子形状的影响，只取决于分子量。影响，只取决于分子量。原态蛋白质 肽链伸展肽链伸展且且SDS 以其烃链与蛋白质分子的侧链以其烃链与蛋白质分子的侧链结合，每克蛋白可结合结合，每克蛋白可结合1.4克克SDS，相，相当于每

9、两个氨基酸残基结合一个当于每两个氨基酸残基结合一个SDS。棒状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（一）（一）胶体性质胶体性质（colloidal system）胶体溶液的特点：胶体溶液的特点：w分子直径在分子直径在1-100 nm1-100 nm内内w溶于水溶于水w不易聚集沉淀不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液如：NH3、COO 、OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将吸附水分子，使

10、蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因：、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。 2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成与周围的反离子构成稳定的稳定的双电层双电层。使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。一定距离，不致互相凝聚而沉淀。 +带正电荷的蛋白

11、质带正电荷的蛋白质蛋白质溶液由于具有蛋白质溶液由于具有水化层水化层与与双电层双电层两方面的稳定因素，所两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。以作为胶体系统是相对稳定的。蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用 由于胶体溶液中的蛋白质不能通由于胶体溶液中的蛋白质不能通过过半透膜半透膜，因此可以应用透析法将，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。非蛋白的小分子杂质除去。透析法：透析法：以半透膜提纯蛋白质的方以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析法法叫透析法半透膜：半透膜：只允许溶剂小分子通过，只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃

12、纸等火棉胶、玻璃纸等 如果破坏这如果破坏这两个因素，蛋两个因素，蛋白质溶液会出白质溶液会出现什么现象？现什么现象？+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质（二）蛋白质的（二）蛋白质的沉淀沉淀 Pr从胶体溶液中析出从胶体溶液中析出任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白质沉淀任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白质沉淀I I 可逆沉淀可逆沉淀温和温和条件，改变溶液条件，改变溶液pH或或Pr所所带电荷带电荷 Pr结构和性质没有变化结构和性质没有变化适当条件下可适当条件下可重新溶解重新溶解 非变性沉淀非变性沉淀 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如如等电点沉淀法

13、、盐析法和有机溶剂沉淀法等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。等。 不可逆沉淀不可逆沉淀 强烈强烈沉淀条件沉淀条件 破坏破坏Pr胶体溶液胶体溶液稳定性稳定性 也破坏也破坏Pr结构和性质结构和性质 沉淀沉淀不能再重新溶解不能再重新溶解变性沉淀变性沉淀 如如加热沉淀、强酸加热沉淀、强酸/ /碱沉淀、重金属盐碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀和生物碱沉淀等等1. 盐析 在蛋白质的水溶液中，加入大量在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的高浓度的强电解强电解质盐质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋白质可破坏蛋白质分子表面的水化层，中和它们的电荷分子表面的水化层，中和它们的电荷

14、，因而使蛋白，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为质沉淀析出，这种现象称为盐析盐析。 而而低浓度低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为白质的溶解度增加，该现象称为盐溶盐溶。盐析的机理盐析的机理： 破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性蛋白质产生变性。如：微生物发酵酶制剂如：微生物发酵酶制剂 各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也

15、有不同，只要调节中性同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分盐浓度，就可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为散沉淀析出，这种方法称为分段盐析分段盐析。 等电点沉淀的蛋白质溶液中等电点沉淀的蛋白质溶液中加入加入NaCl后沉后沉淀溶解淀溶解盐溶盐溶 原因？原因？盐溶盐溶分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少量盐离子量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中溶于水中盐溶2. 有机溶剂沉淀法： 在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的在蛋白质溶液中，加入能与水

16、互溶的有机溶剂如有机溶剂如乙醇、丙酮乙醇、丙酮等，蛋白质产生等，蛋白质产生沉淀。沉淀。有机溶剂沉淀法的机理有机溶剂沉淀法的机理： 破坏蛋白质的水化膜以及降低介电常数而增破坏蛋白质的水化膜以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用加带电质点间的相互作用。注意：注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在有机溶液沉淀蛋白质通常在低温低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。生的溶解热会使蛋白质产生变性。3.弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀） 用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处处于等电点处于等电点处，使蛋白质沉淀。使蛋白质沉淀。弱

17、酸或弱碱沉淀法机理弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷，蛋白质分子带有相破坏蛋白质表面净电荷，蛋白质分子带有相同数量的正负电荷，因此，蛋白质分子相互吸同数量的正负电荷，因此，蛋白质分子相互吸引，从而聚集沉淀。引，从而聚集沉淀。酸酸酸酸碱碱碱碱碱碱酸酸溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉4.重金属盐沉淀(条件：pH 稍大于pI为宜) 当当pH 稍大于稍大于pI时，时，蛋白质颗粒带负电荷这蛋白质颗粒带负电荷这样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉沉淀。淀。重金属沉淀法的机理重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合重金属盐加入之后，与带负电

18、的羧基结合。 例如：例如：“牛奶解毒，汞消毒牛奶解毒，汞消毒”5.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI） 生物碱生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮含氮的碱性物质。的碱性物质。 能够沉淀生物碱的试剂称为能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂生物碱试剂。生物生物碱试剂一般为碱试剂一般为弱酸性物质弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。氯乙酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理生物碱试剂沉淀蛋白质的机理： 在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀剂的酸根离子结合而产生沉

19、淀。 例如：例如：“柿石症，啤酒澄清柿石症，啤酒澄清”6.加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固固。少量盐促进蛋白质加热凝固少量盐促进蛋白质加热凝固。 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速完全和最迅速. 如：如：煮鸡蛋煮鸡蛋 酶的制备：酶的制备：超氧化物歧化酶的提取超氧化物歧化酶的提取原因：天然结构解体，疏水基外露，原因：天然结构解体，疏水基外露， 破坏水化层及带电状态破坏水化层及带电状态四、蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活总目标：增加制品纯度或比活1.1.前处理：因动前处理：因动/ /植物植

20、物/ /细菌而异细菌而异2.2.粗分级分离：采用盐析粗分级分离：采用盐析/ /等电点沉淀等电点沉淀/ /有机溶剂分级分离等方法有机溶剂分级分离等方法3.3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等换层析、吸附层析以及亲和层析等4.4.结晶是最后步骤结晶是最后步骤五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据根据分子大小不同分子大小不同的纯化方法的纯化方法 1、透析和超过滤、透析和超过滤w利用蛋白质分子不能透过半透膜将其利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开与小分子物质分开w半透膜为玻璃纸或纤维素材料半透膜为玻璃纸或纤维素材料血液透析血液透析

21、小分子溶出小分子被带出小分子被带出透析机透析机透析液透析液加加压压血液血液2 2、密度梯度（区带）离心、密度梯度（区带）离心用一定的介质（如蔗糖）在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将蛋白质混合液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使蛋白质分层、分离。 3、凝胶过滤、凝胶过滤3. 凝胶过滤（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法 1. 1.等电点沉淀等电点沉淀 调整溶液调整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI处依次沉淀处依次沉淀 2.2.盐溶和盐析盐溶和盐析3.3.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法w降低介电常数降低介电常数w争夺水化膜争夺水化膜影响溶解度的外部因素有：pH值、离子强度、介电常数和温度。4. 温度对蛋白质溶剂度的影响温度对蛋白质溶剂度的影响（三（三) )根据电荷不同的分离方法根据电荷不同的分离方法1.1.电泳电泳原理：原理： 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 0 分子大小不同，电场中移动速度也不同分子大小不同，电场中移动速度也不同平板电泳平板电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳双向电泳双向电泳离子交换层析离子交换层析（四）利用蛋白质选择性吸附的性质（四）利用蛋白质选择性吸附