3T3细胞中性红摄取光毒性试验方法研究进展

1、3T3细胞中性红摄取光毒性试验方法研究进展XXX综述（广东省疾病预防控制中心）关键词：3T3，光毒性，体外替代试验前言：光毒性是指一次接触化学物质后的皮肤继而暴露于紫外线照射下所引发的的一种皮肤毒性反应，亦或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照射下发生的类似反应。而近年来的临床应用过程中，很多不同类型的药物均出现了光毒性反应。当中包括了临床上常用的氟喹诺酮类抗菌药、非甾体消炎药物、抗组胺药物、抗抑郁药物、抗惊厥药物、利尿剂、抗真菌药物和抗高血压药物等1-4,引起了人们对药物光毒性的关注。而目前对于药物光毒性的检测，传统的光毒性检验以动物试验为主，光毒性动物试验简单，方法成熟，但试验周期长，成本

2、高，某些反应会给动物造成极大的痛苦，存在一定的伦理问题，且结果外推存在差异1，9。而3T3中性红光毒试验（3T3NRUTest）作为动物皮肤光毒性试验的一种体外替代方法，已通过欧洲的欧洲体外替代试验有效性验证中心（ECVAM）验证并收录进OECD化学物质毒性试验指南10，具有试验操作简单，费用低，重现性好，试验周期短，且与体内试验结果的相关性好等特点，该方法目前已广泛应用于化妆品、新药、化学品的光安全性评价1。本综述目的是对3T3细胞中性红摄取光毒性试验方法的研究进展做归纳。一、3T3细胞中性红摄取光毒性实验方法1. 实验原理许多类型化学物质可以引起光毒性反应，其简单的特征为能够吸收阳光中的能

3、量。根据光化学和光反应的第一定律，要求能够充分地吸收光量子。因此，在进行生物学实验之前，必须确定化学物质的紫外线吸收光谱。如果这种物质的摩尔消光系数/吸收系数小于10L/molcm,那么这种物质则没有潜在的光反应，同样不必进行体外3T3光毒性实验，以及其他光化学毒性反应的生物学实验。正常状态下，细胞能够吸收生物活性染料（如中性红），当细胞受到损伤后，吸收生物活性染料的能力降低；细胞膜受到伤害后，吸收的生物活性染料很容易泄露等。因此，体外3T3细胞光毒性实验是根据比较化学物质的光化学细胞毒性而进行的，即细胞暴露和非暴露于无细胞毒性剂量下紫外线（UVA）或光线，验证待测化学物质是否具有光毒性。在该

4、实验中，细胞毒性表现为，细胞吸收生物活性染料中性红的能力降低。2. 实验材料2.1 细胞：小鼠成纤维细胞系Balb/c3T32.2培养基：3T3细胞用培养基为DMED，添加10%新生牛血清和4mM谷氨酸盐。2.3待测化学物质准备：待测物质必须新鲜配制，光稳定性较差的物质应在红光下进行操作。2.4紫外线光源：UVA灯2.5其他：四甲基偶氮唑盐（MTT）、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪等。3. 实验方法3.1 细胞准备：复苏后细胞适当浓度接种培养。实验前，细胞必须有至少一次的传代。3.2 实验步骤3.2.1 细胞接种培养(第一天)按每孔0.2ml细胞悬液(5.0X104/ml)，将3T3细胞接种

5、到96孔板。任何一种待测物质均需要准备两块96孔板接种3T3细胞；不照射UVA用来确定物质的细胞毒性(-UVA),另一块照射UVA用于判断物质的光毒性(+UVA)。接种后的96孔板放置在37C、7.5%CO2培养箱中，培养24h，或直到细胞处于半融合状态。23.2.2 细胞染毒与光照(第二天)将培养细胞的培养基移出，150uL的EBSS或PBS冲洗两次，加入100uL含有不同浓度物质的EBSS/PBS，在暗处继续培养细胞60min(37C、7.5%CO/后进行光毒性实验：96孔板置于强度为1.67mW/cm2UVA，室温下照射50min(=5J/cm2)，对照板(-UVA)放置在暗处，室温50

6、min。然后将溶液移出，150uL的EBSS或PBS冲洗两次，加入新鲜培养基后培养(37C、7.5%CO2)过夜(18-22h)。3.3.3 细胞毒性检测(第三天)将培养基移出，使用150uL的EBSS或PBS冲洗两次，加入100uL含中性红培养基培养3h(37C、7.5%CO2)。培养终止后，用150uL的EBSS或PBS冲洗两次，精确加入150UL中性红吸收液(新鲜配制)，充分混匀。利用酶标仪在波长540nm处测定96孔板孔各孔的光密度。4. 结果评价5.1 判断模型1(光刺激因子，photoirritationfactor，PIF)情况(1)：如果-UVA和+UVA光毒性实验资料完全，可

7、以获得剂量-效应关系曲线并计算得出EC，50可以按照公式(1)计算PIF：PIF=EC(-UVA)/EC(+UVA)公式(1)5050PIFPIF值：PIF=Cmax(-UVA)/EC(+UVA)公式(2)50情况(3)：如果只能获得PIF,那么任何1的值均意味着该化学物质具有光毒性。当最高浓度的-UVA和+UVA均未出现细胞毒性，无法计算EC(-UVA)与EC(+UVA)比值，则表示化5050学物质无光毒性，实验结果为PIF等于1：PIF=1=Cmax(-UVA)/Cmax(+UVA)公式(3)PIF=1，表明待测物质无光毒性。当处在情况(2)和(3)下判断待测物质的光毒性，应该仔细地考虑实

8、验中的受试浓度。5.2 判断模型2(平均光效应)有一种新模式用来判断物质光毒性，来源于欧盟EU/COLIPA。该模型克服了PIF模型在某些情况下不能计算EC的局限性，命名为平均光效应模型(mean-photo-effect,MPE)。50因MPE运用中需要用特殊的计算机软件，目前未普及。5. 结果解释体外3T3细胞中性红光毒性实验结果呈现阳性结果(PIF三5或MPE三0.1),表明待测物质具有光毒性。如果结果是在低于10ug/ml浓度时获得，该物质在其他实验条件下(如体内实验）也可以表现出具光毒性；如果结果只是在高浓度lOOug/ml时获得，则需要进一步研究，以判断物质的危害和潜在的光毒性，包

9、括经皮渗透吸收，以及物质在皮肤中的累积，可采用其他实验方法如体外皮肤实验模型进行研究。体外3T3细胞中性红光毒性实验结果呈现阴性结果（PIF5或MPE10的化学物为有光毒性。尽管如此，有欧洲的权威组织（EMA）已经接受，将这个分子消光系数的标准提高到1000。对于某些样品（如甲醇），测定其MEC的标准必须精确肯定，。限制在光照底下的待测样品最高浓度在100ug/mL，而在非光照样品只需考虑其PIF的抑制浓度（如有需要）。根据研究表明，对于无光毒性的阈值，比起PIF2或者MPE0.1,目前更普遍认为PIF5或者MPE0.1更适合作为标准。国外也有指出，阳性结果不能作为一个评定的特征或者标准，也就

10、是说，光刺激因子阳性并不能作为单一评定光毒性的标准，应作进一步通过模拟人体的试验从而获得能够反映出人体环境的数据分析，例如3D人体皮肤模型。而最近也有研究表明在人体暴露水平已知的情况下，与光照射下的抑制浓度作比较更能有助于评估临床意义。因此更需要关于人体光毒性风险的附加数据作为参考11。但仍有一部分因数据累积少而导致可靠性低的试验存在13，但在将来数据累积以及建立这方面的缺陷能有效减少，根据INVITTOX协议的第78号文和OECDTG432的标准，3T3中性红细胞光毒性试验的试验者应该尽可能多地进行数据的收集，以及尽可能进行共享(当中应该包括所有的基本参数数据)，并有后续的进展以及修改(如光

11、照下得出的IC的最大值，50PIF/MPE获得的最小值)g。随着近年来动物保护运动日益加强，“替代，减少，优化”的3R精神逐渐被引入到国际贸易领域中，各类物质的光毒性试验或过敏性试验逐渐向非动物方面转移。3T3细胞中性红光毒性试验的普及和开发是大势所趋，但由于3T3细胞光毒性试验对受试物的pH值、测试浓度、照射用的UV光源、细胞株对UV的敏感性、来源等均有一定的要求，所以在国内的毒理学安全性评价还需要进一步验证9。参考文献1 涂宏刚，黄鹏程.3T3细胞中性红光毒性试验方法的建立与验证J.世界临床药物,2015,36(8):12 汪细和.第23卷第8期J.氟喹诺酮类药物的光毒性，2004,23(

12、8):13 张婷，屠曾宏.氟喹诺酮类药物的光毒性J.世界临床药物，2003,24(3):14 潘玲珍，龚立，唐春艳.盐酸莫西沙星和喹诺酮新药KNT的体外光毒性比较研究J.中国抗生素杂志，2014,39(1):15 胡玥，石劲敏.BALB/c3T3细胞中性红摄取试验预测化合物急性毒性的验证研究J.中南药学，2015,13(9):26 张宏伟，董少霞.利用体外3T3细胞中性红摄取试验检测化学物质光毒性作用J.卫生研究，2005,34(5):27 刘之岱，熊丽丹，李利.体外3T3细胞光毒性中性红摄取法评价化妆品的光毒性作用J.日用化学工业，2012,42(2)8 杨晓冉，郑洪艳.两种3T3光毒性试验

13、方法在防晒化妆品光毒性评价中的应用J.中国组织工程研究与临床康复，2009,13(34)9 熊习昆，杨颖，谭小华.3T3中性红试验在化妆品光毒检测中的应用J.中国公共卫生，2006,22(10)10 肖萍，仲伟鉴.3T3中性红摄取光毒性实验检测化学物的光毒性作用J.毒理学杂志，2010,24(1)11 Mara,Ceridono,Par,Tellner.The3T3neutralreduptakephototoxicitytest:Practicalexperienceandimplicationsforphototoxicitytesting-ThereportofanECVAM-EFPIAworkshop.RegulatoryToxicologyandPharmacology,2012,(63):480-48812 Lorena,R,Gaspar,Julian,Tharmann.SkinphototoxicityofcosmeticformulationscontainingphotounstableandphotostableUVfiltersandvitaminApalmitateJ.ToxicologyinVit