基因工程的基本操作步骤学习教案

1、会计学1基因工程基因工程(jyn gngchng)的基本操作步骤的基本操作步骤第一页，共42页。基因工程基因工程(jyn gngchng)(jyn gngchng)基本操作基本操作的四个步骤的四个步骤1 1、目的、目的(md)(md)基因的获取基因的获取2 2、基因、基因(jyn)(jyn)表达载体的构建表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定第1页/共41页第二页，共42页。一、目的基因一、目的基因(jyn)(jyn)的的获取获取1 1、目的、目的(md)(md)基因主要是指基因主要是指_编码蛋白质的结构编码蛋白质

2、的结构(jigu)(jigu)基因基因也有一些具有调控作用的因子也有一些具有调控作用的因子2 2、获取目的基因的方法、获取目的基因的方法（1 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取（2 2）利用）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（3 3）人工合成）人工合成_第2页/共41页第三页，共42页。( (一一) )从基因文库中获取从基因文库中获取(huq)(huq)目的基因目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，片断，导入到受体菌的群体中，各个导入到受体菌的群体中，各个(gg)(gg)受体菌受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文分别含有这种生物的不同基

3、因，称为基因文库。库。2.2.基因文库的分类基因文库的分类(fn li):(fn li):种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部部分分基因，如：基因，如：cDNAcDNA文库文库第3页/共41页第四页，共42页。限制酶限制酶拼接到载体上拼接到载体上导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增 基因组文库基因组文库(wnk)3 3. .基因文库的构建方法基因文库的构建方法第4页/共41页第五页，共42页。提取生物提取生物(shngw)(shngw)某发育时期某发育时期的的mRNAmRNA单单 链链DNAD

4、NA逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链CDNACDNA( (只含该生物部分只含该生物部分(b fen)(b fen)基因基因) )与载体与载体(zit)(zit)连接导入到受体菌群储连接导入到受体菌群储存存 cDNAcDNA文库文库第5页/共41页第六页，共42页。基因组文库基因组文库(wnk)(wnk)和和cDNAcDNA文库文库(wnk)(wnk)比较比较第6页/共41页第七页，共42页。原核细胞的基因原核细胞的基因(jyn)(jyn)结构结构( (补充内容补充内容）非编码非编码(bin m)(bin m)区区非编码非编码(bin m)(bin m)区区编码区编码区编码区上游

5、编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 , ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达, ,上上 游有启动子，下游有终止子游有启动子，下游有终止子第7页/共41页第八页，共42页。真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构(jigu)(jigu)（补充内容（补充内容）编码编码(bin (bin m)m)区区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合结合(jih)(jih)位点位点内含子内

6、含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核细真核细胞的胞的 基因结基因结构构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用, ,上游有启动子，下游上游有启动子，下游有终止子有终止子非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子第8页/共41页第九页，共42页。原核细胞与真核细胞的基因原核细胞与真核细胞的基因(jyn)(jyn)结构结构比较比较思考思考(sk(sko)o)编码相同编码相同(xin tn)(xin tn)

7、数目氨基酸的蛋数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码第9页/共41页第十页，共42页。第10页/共41页第十一页，共42页。基因组文库基因组文库(wnk)(wnk)和和cDNAcDNA文库文库(wnk)(wnk)比较比较第11页/共41页第十二页，共42页。依据：目的依据：目的(md)(md)基因的有关信息基因的有关信息如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋

8、白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性4.4.从基因从基因(jyn)(jyn)文库中得到目的基因文库中得到目的基因(jyn)(jyn)的的方法方法第12页/共41页第十三页，共42页。概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成的核酸合成(hchng)(hchng)技术技术 条件条件(tiojin)(tiojin)：_、_、_ _ 、 _ _ 、_ _ 原理原理(yunl)(yunl)：_聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制模板模板DNA DNA 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA引物引物热稳定热稳

9、定DNADNA聚合酶聚合酶（二）（二）利用利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：_指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内使目的基因的片段在短时间内大量大量扩增扩增第13页/共41页第十四页，共42页。过程过程(guchng)(guchng)a a、变性（、变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂断裂(dun li)(dun li)，形成，形成_b b、复性（复性、复性（复性55-6055-60）：系统温度降低）：系统温度降低(ji

10、ngd)(jingd)，引，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链前提前提_ 有有一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列第14页/共41页第十五页，共42页。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列(xli)(xli)mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列(xli)(xli)结构基因结构基因(jyn)(jyn)的核的核苷酸序列苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化

11、学合成（DNADNA合成仪）合成仪）（三）人工合成（三）人工合成若基因若基因_，核苷酸序列，核苷酸序列_ _ ，可用此法。，可用此法。较小较小已知已知（化学合成法）（化学合成法）第15页/共41页第十六页，共42页。mRNAmRNAcDcDNANA单链单链cDNAcDNA分子分子(fnz)(fnz)逆转录酶逆转录酶DNADNA聚合酶聚合酶（三）人工合成（三）人工合成(rn n h (rn n h chn)chn)（反转录（反转录(zhun l)(zhun l)法）法） 与直接提取的与直接提取的DNADNA相比相比cDNAcDNA不含有不含有_ 和和_等结构。等结构。第16页/共41页第十七页，

12、共42页。第17页/共41页第十八页，共42页。a a、使目的基因在受体细胞中稳定存在、使目的基因在受体细胞中稳定存在(cnzi)(cnzi) 并遗传给子代并遗传给子代b b、同时使目的基因、同时使目的基因(jyn)(jyn)能表达和发挥能表达和发挥作用作用1 1、基因表达载体、基因表达载体(zit)(zit)的构建目的的构建目的二二、表达载体的构建表达载体的构建第18页/共41页第十九页，共42页。2 2、基因表达、基因表达(biod)(biod)载体的载体的组成：组成： 目的目的(md)基因基因 标记标记(bioj)基因基因 启动子启动子 终止子终止子第19页/共41页第二十页，共42页。

13、启动子：位于基因的首端的启动子：位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转位，有了它才能驱动基因转录出录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的终止子：位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，能终片断，能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记标记(bioj)(bioj)基因的作用是基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来基因的细胞筛选出来第20页/共41页第二十

14、一页，共42页。用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因的基因(jyn)(jyn)，使其产，使其产生生_ _ _。3 3、基因、基因(jyn)(jyn)表达载体的构建表达载体的构建将切下的目的基因片段插入将切下的目的基因片段插入(ch r)(ch r)质粒的质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同 ( (插入式插入式) )第21页

15、/共41页第二十二页，共42页。用一定的用一定的_切割切割(qig)(qig) 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成，形成(xngchng)(xngchng)了一个了一个重组重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制限制(xinz(xinzh)h)酶酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同用同种限制酶分别切割质粒和目的基因，使之露出

16、用同种限制酶分别切割质粒和目的基因，使之露出相同的相同的黏性末端黏性末端，在加入，在加入DNADNA连接酶。连接酶。第22页/共41页第二十三页，共42页。三、将目的三、将目的(md)(md)基因导入受体细基因导入受体细胞胞将目的基因导入将目的基因导入植物植物(zhw)(zhw)细胞细胞将目的将目的(md)(md)基基因导入因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa+ +处理法处理法第23页/共41页第二十四页，共42页。1 1、将目的基因、将目的基因(jyn)(jyn)导入

17、植物细胞的方导入植物细胞的方法：法：易感染易感染(gnrn)(gnrn)双子叶植物和裸子植物双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染，对大多数单子叶植物没有感染(gnrn)(gnrn)能力能力原理原理(yunl)(yunl)：农杆菌特点：农杆菌特点：（1）农杆菌转化法）农杆菌转化法TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。第24页/共41页第二十五页，共42页。过程过程(guchng)：1、将目的、将目的(md)基因插入到基因插入到Ti质粒的质粒的T-DNA上上2、将重组、将重

18、组(zhn z)Ti质粒导入农杆菌质粒导入农杆菌3、用农杆菌感染植物体细胞、用农杆菌感染植物体细胞第25页/共41页第二十六页，共42页。（2 2）基因）基因(jyn)(jyn)枪法枪法第26页/共41页第二十七页，共42页。第27页/共41页第二十八页，共42页。方法：显微方法：显微(xin wi)注射法注射法程序：程序：取卵取卵显微显微(xin wi)(xin wi)注射注射受精卵受精卵早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植第28页/共41页第二十九页，共42页。3 3、将目的基因、将目的基因(jyn)(jyn)导入微生物细导入微生物细胞胞用用Ca2+Ca2+处理处理(chl)(chl)

19、细胞细胞 原核生物原核生物(shngw)特点：特点： 繁殖快、单细胞、遗传物质少繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子感受态细胞感受态细胞第29页/共41页第三十页，共42页。四、目的基因四、目的基因(jyn)的检测与鉴定的检测与鉴定大肠杆菌大肠杆菌第30页/共41页第三十一页，共42页。四、目的基因四、目的基因(jyn)的检测与鉴的检测与鉴定定个体水平的鉴定个体水平的鉴定第31页/共41页第三十二页，共42页。四、目的基因四、目的基因(jyn)的检测与鉴定的检测与鉴定个体水平个体水平(shupng)(shupng)的鉴定（受体是否表现出相应的鉴定（受体是否表现出相应性状）性状）第32页/共41页第三十三页，共42页。 含有目的含有目的(md)(md)基因基因 单链单链 标记标记(bioj)(bioj)放射性同位素或放射性同位素或荧光荧光第33页/共41页第三十四页，共42页。第34页/共41页第三十五页，共42页。第35页/共41页第三十六页，共42页。第36页/共41页第三十七页，共42页。第37页/共41页第三十八页，共42页。