第五章 有机溶剂中的酶催化作用

1、匕第五章有机溶剂中的酶催化反应I第一节非水介质中酶学基础用于酶催化的非水介质包括：-含微量水的有机溶剂-与水混溶的有机溶剂和水形成的均一体系-水与有机溶剂形成的两相或多相体系-胶束与反胶束体系超临界流体-气相3蠱有机介质中的酶促反应的优越性原先的认识：1）我们以前的酶学理论知道，酶溶解在水溶液中，而且又知道水是个极性分子，酶只能在极性溶剂中反应。2）我们又知道，用了以后,应该在尽可能短的时间内去除有机溶剂，再把酶溶解于水中，以防止酶的变性和失活。现在酶工程技术的发展，已经告诉我们，酶鯉反应可在有机介质中进行，已经成为酶工程、酶鸞蟹化工研究的一个新的领域，开辟了一个新的研究鹽K方向。有机介质中酶

2、促反应优越性被认为至少有以下优点:1）有利于疏水性底物反应2）提高酶反应T,加速反应V,提高酶反应稳定性。3）可以催化一些在水相中不能进行的反应。4）可以改变反应的平衡方向。5）控制底物的专一性。6）防止由水引起的付反应。7）扩大反应的pH范围.有利于酶的固定化。9）酶、产物容易回收。11）防止微生物的污染。10）消除底物、产物的抑制作用。第二节反应条件：一句话，条件要适宜，在一个特定条件下进行，O一、保证必需水含量因此与酶分子紧密结合的一单层水分子对催化作用非常重要。而其他的水则相对不那么重要（即由有机介质替代的那部分水不那么重要了）0水是保证酶催化反应的必需条件，活性构象是水分子直接或间接

3、由氢键等非共价键相互作用来维持。必需水：是维系酶构象稳定和酶催化活性所必需的那部分最少量的水分子，有时也叫结合水,或者束缚水。只要那部分必需水不丢失，其他的大部分水可以由有机溶剂代替.所以，有机介质中的酶促反应在微观上看是水的酶反应，但是在宏观上看是有机介质中的酶反应。如有的酶反应即使水只占0.015%,酶仍然有活性，可以进行酶反应，而且反应速度非常快。9下面是一个胰脂肪酶的反应速度水含量的关系图。00-6水i农度gi%)1.291胰脂肪酶活性与含水呈的关系13一般认为，一个酶结合水的过程分4步：1首先与酶分子表面的带电基团结合一部分水（00.07g/g（水/酶）2.再与褊分子表面的极性墓团结

4、合一部分水（0.070.25g/g（水/酶）。3再聚集到表面相互作用较弱的部位（0.25-0.38g/g（水/酶）。4最后酶分子表面完全水合化，水分子覆盖酶分子表面。必需水含量问题:一般因酶分子本身，或溶剂系统不同而有所不同。如脂肪酶有几个水分子，胰凝乳蛋白酶几十个水分子,乙醇脱氢酶、多酚氧化酶有几百个水分子。一般酶要发挥它的催化活性，必须与有机溶剂系统获得水分以维持酶必要的水合状态。另外同一个酶在不同溶剂系统中含水也不同。如胰凝乳蛋白酶，在甲苯中，含水0.5%；氯仿等系统中，含水1.0%,酶活性最高。酶种类的选择E.酶选择原则：在有机介质中酶有不变性的潜在能力，即能保持酶催化活性的构象和催化

5、能力。由于酶的组成、结构、构象多样化，所以不能认为所有的酶都可以在有机介质中反应。但是，一般现在的资料显示认为大多数酶可以做至U。而有些酶在有机介质中可以进行，在水中却不能反应，如脂肪酶、蛋白酶、次黄卩票吟氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、醛缩酶、多酚氧化酶、醇脱氢酶、细胞色素氧化酶、ATP酶，胆固醇氧化酶等。这些酶有些属膜酶，在水溶液中反而不稳定。酶是否适于在有机介质中反应，除与酶性质有关外，还取决于酶底物、产物溶剂间的关系冋题。四、酶形式的差别酶在有机介质中的溶解特性、稳定性、活性等，对酶的选择很重要。1) boooooooo粉将酶做成冻干粉，然后在有机介质中充分搅拌，超声波处理，使得颗粒变

6、小，悬浮于介质中。2) 控制酶量的问题需要适量。如Q-凝乳蛋白酶在乙醇中的转脂反应，随着加酶量的下降，活性反而上升，速度快。可能理由：少了底物扩散的限制，酶反应速度反而加快。14被认为在水含量不变的情况下，酶少到一个合适的浓度,可以使酶聚合体变小，反而增大了酶-底物接触的面，减FMW頤诙17M化学修饰方法很多，聚乙二醇（PEG）修彝饰较常见。跖如PEG修饰过氧化氢酶，然后在有机介质豊中活性显著提高。还研制了磁性脂肪酶（磁性颗粒外包翹PEG修饰的脂肪酶），它在有机介质中较稳定,鱷活力也较高，且可在磁场中回收。还有用谷氨酸、十二醇、葡萄糖酸内酯鑿合成了糖脂后修饰超氧化物歧化酶（SOD）oM所得的这

7、种SOD糖脂复合物变成脂溶性的酶，薛而不是水不溶性的。SOD糖脂复合物在有机介凝质中活性高大大高于在水中的活性，并且它对擁温度、pH、蛋白酶水解等的稳定性均高于天蠡然SOD。16还有用聚磷酸酯、脂肪酸等修饰SOD,同样得到了适合于有机介质中进行催化反应的化学修饰酶-SODo筑.在进行了不同化学修饰酶在有机介质中pi的反应的研究以后，发现化学修饰（采用脱糖基化、PEG修饰等）能够酶的表面疏水,而疏水性的增加正是提高酶在有机介质中111的溶解性和活力的重要原因。BlPEG修饰酶在甲苯中的活性比未修饰酶高16倍。通过作用或疏水分子擁对酶蛋白的修饰，均可提高酶在有机介质中的溶解性、稳定性和活性。）固定

8、化酶第二章已经讲到固定化酶和细胞的问题，固定化有许多好处。在有机溶剂中进行酶反应，如果进行酶的固定化，必定可以充分显示其优舷性。酶被吸附或者固定在固相载体（水不溶性）力，上，就可以对抗有机介质对酶的变性能提高反应的速度和对热的敏感性O载体通过分配效应剧烈地改变酶所处的微环境中底物和产物的局部浓度。固定化后，首先使载体能通过分配效应改变酶所处微环境中底物和产物的局部浓度。例子：在水溶液中，底物肉桂醇浓度在O.1mmol/L以上可强烈抑制马肝醇脱氢酶活f生。现在它在乙酸丁酯中使用亲水载体固定化酶，底物浓度高达50mmol/L也不会发生抑制作用。还有个例子：研究几种不同载体的固定化脂肪酶时发现，疏水

9、性琼脂拯識袜的固定化效臬最女彳。固定化后脂肪酶在有机介质中的活性比对应酶粉高46.5%。由于载体上疏水基团的存在，使疏水性底物在疏水作用下分配到载体周围的浓度高于皮应介质申的浓皮。彳吏酶反应速度握高。19»其次，载体影响酶分子上的结合水。亲水性高的载体会从溶剂和酶分子中夺取大;層量的水，造成酶部分失水而降低酶的活性；蛛亲水性低的载体不足以夺取酶的必需水，能霸保持它的高酶活性。M还有通过载体与酶之间形成的多点的蠶结合作用，可稳定酶的催化活性构象。例如,霸0(胰凝乳蛋白酶与聚丙烯酰胺凝胶共价结合后，在乙醇中的稳定性明显提咼，并且对有洼机溶剂的抗性随酶与载体间共价键数量的增囑加而增强。&#

10、163;均fflI玫#a有机濬和粗威的各幵反应承域>r-F另外载体问题还会影响酶的动力学。如影响一个酶同时催化两个反应的相对速度。在低水活度下把胰凝乳蛋白酶固定在聚酰胺载体AccurelPA6上，水解反应被抑制，却有利于醇解反应进行。这是固定化后发生的另外一种情况。一般来说，目的是为了有利于在有机溶剂中反应。如用具有高氧渗透性的硅聚合物比较好。用固定化材料，还应考虑载体的酶负载量、颗粒大小、表面积、内部孔径大小、酶与载体间的相互作用等。#五、溶剂的选择1水溶性有机溶剂醇、2.水不溶性有机溶剂石油醸、三氯乙烷、乙酸乙酯、苯、己烷等在这些酶反应溶剂的选择中，介质的组成一般可有四种：1）单相共

11、溶剂系统（水与能与水相溶的有机溶剂）2）双相溶剂系统（水与跟水不相溶的有机溶剂）3）低水有机系统4）反向微团系统图十六烧基三甲基傲澳化物/水/乙醇系疑的相示X圈<a>正常徽团eF施血栽团.54的洁勵中介相!玄片展伙耙BB柱蕨住O.-%二；二'!-LB>.i.fL：oI八A,<*B.-4B.".u31右圳幡刑ASa.F*7分率于反冋徴团中的底物（或其它试*RD分子和包埋着亲水声类作2、表而窗蛰CEQ以及疏水吳佗/相互作用示意88.r.己烷中視童质0脂复合物華构示羸B9<*>类酯*<2）水申3>亲水StBta<4?莫水肚段.在

12、上面四种系统中，1-3用的多原因是：1）因为这几个系统容易建立2）产物和酶容易回收其中又以低水有机系统为好，因为适合疏水的有机溶剂和耐高温（增加稳定性）。缺点：扩散差，所以反应速度慢等。克服的方法：选用反向微团系统。10反向扳团内蘋白质枸象波动祓消除的可能机理在水中这科波动通帯拓破坏催化活性部位桂I象。矗那么，有机溶剂最终是如何影响酶反应的？M_般解释有如下几种：>；1）通过底物、产物在水相和有机溶剂中分配,営;必然影响到底物、产物在酶必需水在水层中的蠶浓度，这样，自然影响到酶的反应速度。M2）必需水对特定的酶是一定的。如果有机溶籍剂与酶的必需水作用，夺取酶的必需水，一定曇影响酶的活性。

13、H如果是极性强的有机溶剂，夺取酶的必需瓏水就多，酶就可能最终失活。M如果是一般的有机溶剂，夺取酶的必需水攣不明显,就最适合酶在这类有机溶剂中反应。有一个例子十分明显。M胰凝乳蛋白酶，在辛烷中的反应速度比卩比噪；中快104倍。酶活性随着疏水性增加而增加。豊：勺3）有机溶剂本身的影响。塾1）有机溶剂使底物基态能级下降或使酶底物复擁合物能级升高，从而增大酶反应的活化能来降I低酶反应速度；圜|刁有机溶剂分子进入酶活性中心，降低活性中H心内部极性并加强底物与酶之间形成的氢键，獰使酶活性下降；”3）有机溶剂侵人会造成酶的三级结构变化，间接改变酶活性中心结构来影响酶活性。正由于以上原因，正确选择有机溶剂显得

14、1十分重要。所以必须考虑以下几种因素：跖丁（1）溶剂与反应的相容性。例如，酶催化糖L修饰反应，必须在亲水性的有机溶剂（加二龟血甲基甲酰胺等）中进行。若使用疏水性有机»溶剂，底物不溶解，酶促反应不能发生。飆1（2）溶剂对主要的反应应该是惰性的。»（3）溶剂的密度、粘度、表面张力、毒性、B应物的处理和成本督。擁但是普遍认为最佳溶剂因底物而异。即一种溶剂在辛醇/水两相间分配系数的常用对薮值（IgP）oP大，酶活性夫，所需要的水量少。后来又有用，在产物中不留下任何溶剂。即在临界温度、临界压力下反应。如用co?作介质，进行多酚氧化酶的催化反应，反应后co?全部从反应体系中自然去除。使

15、转酯反应大大加快O还有用超圖co?作介质，进行脂肪酶的催化反应，可以把压力提高到适当的数值，39O-2图中表示了与气相、液相、固相区相对应的超临界流体区图中直线表示以co?的密度为第三参数的Tp关系。CO?密度随压力与温度的增减而产生较大的变化。如温度为37°C时，压力由7.2MPa(p=0.21g/cm3)上升到10.3Mpa(p=0.59g/cm3),密度增加了2.8倍。当压力为10.3MPa时，温度由92°C下降到37°C,也可发生相应的密度变化。在临界区的附近，压力和温度的微小变化，引起流体的密度大幅度的变化。47pH的选择问题:八、因为在有机介质中的最适

16、pH与水溶液中|的最适pH的酶反应是一样的，所以在进行酶:的冻干时，可以在最适pH的缓冲液中冻干出来，再进行有机系统的反应。I这样，可以使酶在有机溶剂中反应的微环境:遷具有溶液酶的最适pH环境。S第三节有机介质对酶反应的影响总起来讲基本上遵循米氏方程的动力学。但也有一些影响。酶的稳定性问题O,j1）一般被认为酶更加稳定，因为对热的稳定性提高。凝如猪胰脂肪酶在醇和酯中进行反应，100°C温度下反魁应,半衰期12小时以上，活性比25°C时高好几倍。建胰凝乳蛋白酶在60°C水中，几分钟就会有失活。而在辛烷中，半衰期有几个小时。孽2）存储酶的存储稳定性提高蠢胰凝乳蛋白酶2

17、0°C的水中，半衰期只有几天。绡|而在辛烷中，半衰期有6个月，活性全部不损失。iBl活性a）单相共溶剂系统中对酶的影响作用主要是如下：1）有机溶剂直接作用于酶，破坏维持酶活性构象的氢键、疏水键、水化层，酶变性失活。一般有随着有机溶剂浓度上升，活性下降的一般规律。2）但有些酶，有机溶剂的浓度上升，酶活性反而上笄，到一定浓度，醒洁性达最高，如再提高後度,酶活性反而下降。如胰蛋白酶在1,4-T二醇中最适浓度80%猪心线粒体ATPase,在乙醇中最适浓度10%EcoRI内切酶在甘油中最适浓度为20%37b）低水有机系统：有些酶反应会发生变化，如沉淀在玻璃球上的胆固醇氧化酶在有机溶剂中测定胆固

18、醇，速度只是水中的1025%o又如酵母醇脱氢酶在1%的水和醋酸丁酯中反应，酶活性是水中的1-60%左右。总之，酶活性随着水活度的大小而不同，而水活度一定，酶活性会随着载体不同而不同，这是一般的规律。c）反向微团系统:在这个系统中有些酶活性会上升。漆酶（Laccase）与水中的漆酶比较，它水解邻苯二酚氧化的最大速率，催化活性大100倍以上。分析原因：主要是依赖于微团的水化程度，因为水与表面活性剂存在的摩尔比大小。反向微团脂肪酶的最适水化程度R=9.8o过氧化物酶、酸性磷酸酶在反向微团中的活性高成万倍（与水中比）。把活性高于水中的叫分析这种现象的理论很多，主要的解释是：1) 微团的水化程度W二水/

19、表面活性剂其水化程度的最佳值与酶活性最大值成正比例关系C2) W值最佳时，微团内径=酶分子直径，认为酶的超活性是由酶分子外面的表面活性剂这一个外壳的较大的刚性所引起。53专一性:,被认为由二种原一般产生的因引起：1）有疏水骚动力作用的结果。2）酶活性中心刚性的增强引起。例如：脂肪酶是水解脂肪脂肪酸,£1而在有机介质中有合成肽键的功能。i|四、反应方向的改变水解酶类在水介质中，水的浓度为55.5M/L,反应是向右，即水解的方向。而在有机介质中，平衡向左，向合成的方向进行。而且已经应用在工业生产上,如Aspatame（天冬二肽甜味齐！J）的酶法合成。五、分子印迹是一种能够记住酶的活性构象的一种能力。枯是抑制剂导致酶活性中心构象发生变化，形成高活举一个了例子：正丁醇沉淀6凝乳蛋白酶和草杆菌蛋白酶可以从含有竞争