色谱法的产生和发展

1、. .色谱法的产生和开展1906年，俄国植物学家Tswett发表了他的实验结果，他为了别离植物色素，将植物绿叶的石油醚提取液倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸钙颗粒外表的吸附力不同，随着淋洗的进展，不同色素向下移动的速度不同，形成一圈圈不同颜色的色带，使各色素成分得到了别离。他将这种别离方法命名为色谱法chromatography。在此后的20多年里，几乎无人问津这一技术。到了1931年，Kuhn等用同样的方法成功地别离了胡萝卜素和叶黄素，从此，色谱法开场为人们所重视，此后，相继出现了各种色谱方法。色谱法的开展历史年代创造者创造的色谱方法或重要应用190

2、6Tswett用碳酸钙作吸附剂别离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn, Lederer用氧化铝和碳酸钙别离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开场为人们所重视。1938Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor, Uray用离子交换色谱法别离了锂和钾的同位素。1941Martin, Synge提出色谱塔板理论；创造液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相即气相色谱。1944Consden等创造了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中参加淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin, James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法

3、。1956Van Deemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay创造毛细管柱气相色谱。1959Porath, Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore创造凝胶渗透色谱。1965Giddings开展了色谱理论，为色谱学的开展奠定了理论根底。1975Small创造了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。在分析化学领域，色谱法是一个相对年轻的分支学科。早期的色谱技术只是一种别离技术而已，与萃取、蒸馏等别离技术不同的是

4、其别离效率高得多。当这种高效的别离技术与各种灵敏的检测技术结合在一起后，才使得色谱技术成为最重要的一种分析方法，几乎可以分析所有物质，在所有学科领域都得到了广泛的应用。色谱法的优点和缺点1. 色谱法的优点别离效率高。几十种甚至上百种性质类似的化合物可在同一根色谱柱上得到别离，能解决许多其他分析方法无能为力的复杂样品分析。分析速度快。一般而言，色谱法可在几分钟至几十分钟的时间内完成一个复杂样品的分析。检测灵敏度高。随着信号处理和检测器制作技术的进步，不经过预浓缩可以直接检测 10-9g 级的微量物质。如采用预浓缩技术，检测下限可以到达 10-12g数量级。样品用量少。一次分析通常只需数纳升至数微

5、升的溶液样品。选择性好。通过选择适宜的别离模式和检测方法，可以只别离或检测感兴趣的局部物质。多组分同时分析。在很短的时间内20min左右，可以实现几十种成分的同时别离与定量。易于自动化。现在的色谱仪器已经可以实现从进样到数据处理的全自动化操作。2. 色谱法的缺点定性能力较差。为抑制这一缺点，已经开展起来了色谱法与其他多种具有定性能力的分析技术的联用。色谱法的定义与分类固定相stationary phase：在色谱别离中固定不动、对样品产生保存的一相。流动相mobile phase：与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。色谱法：又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质

6、样品与固定相和流动相之间的作用力分配、吸附、离子交换等的差异，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进展屡次平衡，使各溶质到达相互别离。色谱法的分类方法很多，最粗的分类是根据流动相的状态将色谱法分成四大类色谱类型流动相主要分析对象气相色谱法气体挥发性有机物液相色谱法液体可以溶于水或有机溶剂的各种物质超临界流体色谱法超临界流体各种有机化合物电色谱法缓冲溶液、电场离子和各种有机化合物色谱法根本原理根本概念1. 保存时间与容量因子在整个色谱别离过程中，流动相始终是以一定的流速或压力在固定相中流动的，并将溶质带入色谱柱。溶质因分配、吸附等相互作用，进入固定相后，即在固定相外表与功能层分子作用，从而在固定相

7、中保存。同时，溶质又被流动相洗脱下来，进入流动相。与固定相作用越强的溶质在固定相中的保存时间就越长。从色谱柱流出的溶液柱流出物进入检测器连续测定，得到如图7-1所示的色谱图，即柱流出物中溶质浓度随时间变化的曲线，直线局部是没有溶质流出时流动相的背景响应值，称作基线base line。在基线平稳后，通常将基线响应值设定为零，再进样分析。溶质开场流出至完全流出所对应的峰型局部称色谱峰peak，基线与色谱峰组成了一个完整的色谱图chromatogram。死时间(dead time)：在色谱柱中无保存的溶质从进样器随流动相到达检测器所需要的时间，通常用t0表示。溶质保存时间solute retenti

8、on time：或称真实保存时间，是溶质因与固定相作用在色谱柱中所停留的时间，它不包含死时间，通常用tS表示。保存时间retention time：是tS与t0之和，通常用tR表示，即tR = t0 + tS(7-1)容量因子capacity factor：对于有效的色谱别离，色谱柱必须具有保存溶质的能力，而且还能使不同溶质之间到达足够大的别离。色谱柱的容量因子K是溶质离子与色谱柱填料相互作用强度的直接量度，由下式定义： (7-2)式中VR和V0分别为总保存体积和空保存体积。2. 色谱峰的对称性高斯Gaussian曲线：在理想情况下，色谱峰的形状可以近似地用高斯曲线描述图7-2。图中Ó

9、;为标准偏差拐点处的半峰宽，h为最大峰高，w为峰宽。在任意给定位置x处的峰高y可以用下式描述： (7-3) (式中Y0为峰极大值，即Y0=h不对称因子asymmetry：在实际的色谱过程中，溶质从色谱柱中流出时，很少符合高斯分布，而是具有一定的不对称性。我们可以定义一个不对称因子As来定量地表示色谱峰的不对称程度，如图7-3所示，将10峰高处前半峰的宽度设为a, 同高度处后半峰的宽度设为b，将b与a的比值定义为不对称因子As，即 AS=b/a (7-4)拖尾峰tailing peak：当As大于1时，色谱峰的形状是前半局部信号增加快，后半局部信号减少慢。引起峰拖尾的主要原因是溶质在固定相中存在

10、吸附作用，因此，拖尾峰也称为吸附峰。伸舌峰leading peak或fronting peak：当As小于1时，色谱峰是前半局部信号增加慢，后半局部信号减小快。因为伸舌峰主要是固定相不能给溶质提供足够数量适宜的作用位置，使一局部溶质超过了峰的中心，即产生了超载，所以也称超载峰。3. 别离度色谱分析的目标就是要将混合物中的各组分别离，两个相邻色谱峰的别离度Rresolution定义为两峰保存时间差与两峰峰底宽平均值之商，即               (7-

11、5)式中tR1和tR2分别为峰1和峰2的保存时间；w1和w2分别为峰1和峰2在峰底基线的峰宽，即通过色谱峰的变曲点拐点所作三角形的底边长度。计算别离度所需的参数都可以从色谱图图7-4中获得.如果色谱峰呈高斯分布，那么别离度R=2相当于8Ó别离即可完全满足定量分析的需要。因为在基线位置的峰宽w为4Ó，R=2时，两个峰完全到达了基线别离。通过调节色谱条件还可获得更高的R值，不过这时的代价将是分析时间增加。如果两组分浓度相差不是太大，别离度R=0.5时，仍然可以看得出两个峰的峰顶是分开的。4. 选择性系数两个组分到达别离的一个决定性参数就是两组分的相对保存值，将其定义为两个色谱峰

12、真实保存时间tg之比，称作选择性系数，即 (7-6)计算选择性系数所需参数也可以从色谱图图7-4中获得。选择性系数主要由固定相的性质所决定，在高效液相色谱HPLC中，选择性系数也受流动相组成的影响。中选择性系数=1时，那么说明在给定的色谱条件下，两组分不存在热力学上的差异，无法实现相互别离。色谱过程动力学色谱过程动力学研究物质在色谱过程中的运动规律，如解释色谱流出曲线的形状、谱带展宽的机理，从而为选择色谱别离条件提供理论指导。用严格的数学公式表述色谱理论需要根据溶质在柱内的迁移过程及影响这一过程的各种因素，列出相应的偏微分方程组，求出描述色谱谱带运动的方程式。其数学处理相当复杂，方程组的求解也

13、非常困难。在实际研究中，通常要进展适当的条件假设并作简化的数学处理。在此仅作简单介绍。1. 塔板理论塔板理论把气液色谱柱当作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念描述溶质在两相间的分配行为，并引入理论塔板数the number of theoretical platesN和理论塔板高度theoretical plate heightH作为衡量柱效的指标。根据塔板理论，溶质进入柱入口后，即在两相间进展分配。对于正常的色谱柱，溶质在两相间到达分配平衡的次数在数千次以上，最后，"挥发度"最大保存最弱的溶质最先从"塔顶"色谱柱出口逸出流出，从而使不同"挥发

14、度"保存值的溶质实现相互别离。理论塔板数N可以从色谱图中溶质色谱峰的有关参数计算，常用的计算公式有以下两式：7-77-8式中：b1/2为半峰宽；w为峰底宽经过色谱峰的拐点所作三角形的底边宽。理论塔高度H与理论塔板数N和柱长的关系如下： H=L/N7-92. 速率理论为了抑制塔板理论的缺陷，Van Deemter等在Martin等人工作的根底上，比较完整地解释了速率理论。后来，Giddings等又作了进一步的完善。速率理论充分考虑了溶质在两相间的扩散和传质过程，更接近溶质在两相间的实际分配过程。当溶质谱带向柱出口迁移时，必然会发生谱带展宽。谱带的迁移速率的大小决定于流动相线速度和溶质在

15、固定相中的保存值。同一溶质的不同分子在经过固定相时，它们的迁移速率是不同的，正是这种差异造成了谱带的展宽。谱带展宽的直接后果是影响别离效率和降低检测灵敏度，所以，抑制谱带展宽就成了高效别离追求的目标引起谱带展宽的主要因素有涡流扩散eddy diffusion、纵向扩散longitudinal diffusion和两相中传质阻力resistance to mass transfer)引起的扩散。图7-5是色谱柱中溶质谱带展宽的几种主要因素的图示。色谱过程热力学色谱过程热力学就是从热力学和统计力学的观点出发，研究溶质保存值随分析条件、分子构造变化的规律。根据热力学公式RT lnK =和，可以得到7

16、-17式中：K为溶质在两相间的分配系数，为吉布斯生成自由能，为焓变，为熵变，R为气体常数，T为热力学温度。根据容量因子的定义，可以得到：7-18式中Vs和Vm分别表示固定相和流动相体积，由式(7-17)和式(7-18)可以得到：7-19如果色谱条件一定，那么可视为常数。是热力学温度倒数1/T的函数，与1/T的关系曲线称为范特霍夫vant Hoff曲线。范特霍夫曲线是以为斜率的直线。对于吸热过程，小于零，直线的斜率为负；对于放热过程，大于零，直线的斜率为正。气相色谱仪器气相色谱仪流程图气相色谱仪是一个载气连续运行、气密的气体流路系统。气路系统的气密性、载气流速的稳定性及测量的准确性，都影响色谱仪

17、的稳定性和分析结果。图7-7是常用的双气路气相色谱仪的流程图高压钢瓶中的载气气源经减压阀减低至0.2-0.5MPa，通过装有吸附剂分子筛的净化气除去载气中的水分和杂质，到达稳压阀，维持气体压力稳定。样品在气化室变成气体后被载气带至色谱柱，各组分在柱中到达别离后依次进入检测器。减压阀图中7是高压气瓶与减压阀的连接口，气体经针阀4进入装有调节隔膜的出口腔5，出口压力是靠调节手柄1调节。顺时针拧紧，针阀逐渐翻开，出口压力升高；反时针旋松，出口压力减小。稳压阀为后面的针形阀提供稳定的气压，或为后面的稳流阀提供恒定的参考压力。旋转调节手柄，即可通过弹簧将针阀2旋到一定的开度，当压力到达一定值时就处于平衡

18、状态，当气体进口压力P1稍有增加时，P2处的压力也增加，波纹管就向右移动，并带动三根连动阀杆图中只画出一根也向右移动，使阀开度变小，使出口压力P3维持不变，反之亦然。稳流阀程序升温用气相色谱仪通常还配有稳流阀，以维持柱升降温时气流的稳定。其工作原理是针阀在输入压力保持不变的情况下旋到一定的开度，使流量维持不变。当进口压力稳定，针阀两端的压力差P=P3-P2，当P等于弹簧压力时，膜片两边到达平衡。当柱温升高时，气体阻力增加，出口压力P4增加，流量降低。因为P1是恒定的，所以P1-P2小于弹簧压力，这时弹簧向上压动膜片，球阀开度增大，出口压力P4增大，流量增加，P2也相应下降，直至P1-P2等于弹

19、簧压力时，膜片又处于平衡，使气体流量维持不变。进样器略检测器略气相色谱的流动相种类很少，主要是惰性气体氮气或氦气，有时也用氩气或氢气。样品在固定相中的保存主要是吸附和分配机理。根据固定相色谱柱和样品气化方式的不同，气相色谱主要有以下几种分析技术。填充柱气相色谱填充柱气相色谱的柱管通常为长13m，内径23mm的不锈钢管，为节省柱温箱空间而将柱管弯成环状。在管内壁涂渍液体物质气-液色谱或在管内填充固体吸附剂气-固色谱。1. 气-液色谱原理：各溶质在气相流动相和液相固定相间分配系数不同到达别离。固定相：涂渍在惰性多孔固体基质载体或担体上的液体物质，常称固定液。使用过的气-液色谱固定液上千种，常用的固

20、定液有聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇、含5或20苯基的聚甲基硅氧烷、含氰基和苯基的聚甲基硅氧烷、50三氟丙基聚硅氧烷，另外，用于别离手性异构体的手性固定相那么主要有手性氨基酸的衍生物、手性金属配合物和环糊精衍生物。常用的基质：无机载体如硅藻土、玻璃粉末或微球、金属粉末或微球、金属化合物和有机载体如聚四氟乙烯、聚乙烯、聚乙烯丙烯酸酯。2. 气-固色谱气-固色谱的固定相是固体吸附剂，别离是基于样品分子在固定相外表的吸附能力的差异而实现的。常用的固体吸附剂有碳质吸附剂活性炭、石墨化碳黑、碳分子筛、氧化铝、硅胶、无机分子筛和高分子小球。气-固色谱不如气-液色谱应用广泛，主要用于永久气体和低沸点烃类的分析，在

21、石油化工领域应用很普遍。毛细管气相色谱1. 毛细管柱毛细管柱是用熔融二氧化硅拉制的空心管，也叫弹性石英毛细管。柱内径通常为0.1-0.5mm，柱长30-50m，绕成直径20cm左右的环状。用这样的毛细管作别离柱的气相色谱称为毛细管气相色谱或开管柱气相色谱，其别离效率比填充柱要高得多。2. 填充毛细管柱填充毛细管柱是在毛细管中填充固定相而成，也可先在较粗的厚壁玻璃管中装入松散的载体或吸附剂，然后拉制成毛细管。如果装入的是载体，使用前在载体上涂渍固定液成为填充毛细管柱气-液色谱。如果装入的是吸附剂，就是填充毛细管柱气-固色谱。这种毛细管柱近年已不多用。3. 开管型毛细管柱壁涂毛细管柱：在内径为0.

22、1-0.3mm的中空石英毛细管的内壁涂渍固定液。这是目前使用最多的毛细管柱。载体涂层毛细管柱：先在毛细管内壁附着一层硅藻土载体，然后再在载体上涂渍固定液。小内径毛细管柱：内径小于0.1mm的毛细管柱，主要用于快速分析。大内径毛细管柱：内径在0.3-0.5mm的毛细管，往往在其内壁涂渍5-8m的厚液膜。4. 毛细管柱气相色谱分析体系现在的气相色谱仪大都既可做填充柱气相色谱，又可做毛细管柱气相色谱。但在仪器设计上考虑了毛细管气相色谱的特殊要求。(1) 进样系统毛细管气相色谱的开展主要取决于毛细管柱的制作和进样系统。现在多采用分流进样技术。一般气相色谱的气化室体积为0.5-2mL，而毛细管色谱别离的

23、载气流量只有0.5-2mL/min，载气将样品全部冲洗到色谱柱中需要0.25-4min，这样会导致严重的峰展宽，影响别离效果。而且毛细管柱的柱容量低，通常只能进样几个nL的样品，用微量注射器无法准确进样，分流进样器就是为毛细管气相色谱进样而专门设计的(2) 色谱柱连接为了减小色谱系统的死体积，毛细管柱和进样器的连接应将色谱柱伸直，插入分流器的分流点。色谱柱出口直接插入检测器内。(3) 尾吹由于毛细管柱载气流速低，进入检测器后发生突然减速，会引起色谱峰展宽，为此，在色谱柱出口加一个辅助尾吹气，以加速样品通过检测器。当检测池体积较大时，尾吹更是必要的。(4) 检测器各种气相色谱检测器都可使用，不过

24、最常用的为灵敏度高、响应速度和死体积小的氢火焰离子化检测器。也可和各种微型化的气相色谱检测器匹配。裂解气相色谱prolysis gas chromatography裂解气相色谱是一种反响气相色谱，是在严格控制的操作条件下，使天然或合成高分子化合物进展高温热裂解，生成的低分子热裂解产物用气相色谱别离分析。因为裂解碎片的组成和相对含量与被测高分子的构造密切相关，所以，每种高分子的裂解色谱图都各有其特征，称热裂解"指纹"色谱图.1. 裂解器为了获得重现性好的裂解色谱图，关键是要有一个设计合理，具有死体积小、热容量高和升温速度快的裂解器，它是裂解气相色谱的关键部件.管式炉裂解器：通

25、常由一个外壁加热的石英管制成，采用电热丝加热，裂解温度在300-1000，恒温精度高。当炉温到达设定温度，将样品置于铂金小舟内，用推杆将铂金舟送入裂解炉，样品不与管壁接触。该裂解器的优点是构造简单、能定量进样、操作方便、裂解温度连续可调，但其缺点是升温速率不可调、死体积大和容易产生二次反响。热丝裂解器：将直径0.2-0.5mm，长50mm左右的铂丝或镍铬丝绕成螺旋状，样品涂在金属热丝上，热丝用稳定电压加热到所需温度，通电约10秒钟，就可使样品瞬间裂解，裂解产物被载气带入色谱柱。该裂解器构造简单、加热时间短、二次反响少。但缺点是不易定量进样，所以一般只用于定性分析。 居里点裂解器：是一

26、种高频感应加热裂解器，用铁磁性材料作加热元件,将它置于高频电场中，它会吸收射频能量而迅速升温，到达居里点温度时，铁磁质变为顺磁质，那么不再吸收射频能量，温度将稳定在居里点温度。当切断高频电源后温度下降，铁磁性又恢复。将样品附着在加热元件上，样品就可在居里点温度裂解。不同的铁磁质的居里点温度不同，通过调节铁磁质合金的组成就可获得所需温度的加热元件。顶空气相色谱gas chromatography headspase analysis是一种间接分析液体或固体中挥发性成分的气相色谱法，也可以看作是一种气相色谱的进样方式。分静态和动态顶空气相色谱。1. 静态顶空气相色谱静态顶空气相色谱的典型装置，将液

27、体或固体样品置于一个恒温密闭的样品容器中，使其中的挥发性成分逸出，在到达气-液或气-固平衡后采集蒸汽相进展气相色谱分析。2. 动态顶空气相色谱动态顶空气相色谱的典型装置，把液体或固体样品置于样品管中，向样品管中通入惰性气体N2，将待测组分吹扫出来，并使其通过装有吸附剂的捕集管，被吸附剂吸附，然后将吸附剂加热，使被测组分脱附，在用载气将脱附的样品气体带入气相色谱仪中进展分析。因其操作过程中包括了吹扫和捕集两个主要环节,所以也叫吹扫-捕集purge-tranp法.程序升温气相色谱现代气相色谱仪都装有程序升温控制系统，是解决复杂样品别离的重要技术。恒温气相色谱的柱温通常恒定在各组分的平均沸点附近。如

28、果一个混合样品中各组分的沸点相差很大，采用恒温气相色谱就会出现低沸点组分出峰太快，相互重叠，而高沸点组分那么出峰太晚，使峰形展宽和分析时间过长。程序升温气相色谱就是在别离过程中逐渐增加柱温，使所有组分都能在各自的最正确温度下洗脱。.色谱定性与定量分析方法各种色谱分析方法的定性与定量分析的根本方法都是一样的。色谱定性分析1. 保存时间定性在一定的色谱系统和操作条件下，每种物质都有一定的保存时间，如果在一样色谱条件下，未知物的保存时间与标准物质一样，那么可初步认为它们为同一物质。为了提高定性分析的可靠性，还可进一步改变色谱条件别离柱、流动相、柱温等或在样品中添加标准物质，如果被测物的保存时间仍然与

29、标准物质一致，那么可认为它们为同一物质。2. 利用不同检测方法定性同一样品可以采用多种检测方法检测，如果待测组分和标准物在不同的检测器上有一样的响应行为，那么可初步判断两者是同一种物质。在液相色谱中，还可通过二极管阵列检测器比较两个峰的紫外或可见光谱图。3. 保存指数定性在气相色谱中，可以利用文献中的保存指数数据定性。保存指数随温度的变化率还可用来判断化合物的类型，因为不同类型化合物的保存指数随温度的变化率不同。4. 柱前或柱后化学反响定性在色谱柱后装T型分流器，将别离后的组分导入官能团试剂反响管，利用官能团的特征反响定性。也可在进样前将被别离化合物与某些特殊反响试剂反响生成新的衍生物，于是，

30、该化合物在色谱图上的出峰位置或峰的大小就会发生变化甚至不被检测。由此得到被测化合物的构造信息。5. 与其他仪器联用定性将具有定性能力的分析仪器如质谱MS、红外IR、原子吸收光谱AAS、原子发射光谱AES，ICP-AES等仪器作为色谱仪的检测器即可获得比较准确的定性信息。定量分析色谱定量分析的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积或峰高成正比。数据处理软件工作站可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。因为峰高比峰面积更容易受分析条件波动的影响，且峰高标准曲线的线性范围也较峰面积的窄，因此，通常情况是采用峰面积进展定量分析。1. 校正因子定量绝对校正因子fi：单位峰面积所对应的被测物质的浓度

31、或质量，即     7-20 样品组分的峰面积与一样条件下该组分标准物质的校正因子相乘，即可得到被测组分的浓度。绝对校正因子受实验条件的影响，定量分析时必须与实际样品在一样条件下测定标准物质的校正因子。相对校正因子:某物质i与一选择的标准物质S的绝对校正因子之比。即 相对校正因子只与检测器类型有关，而与色谱条件无关。2.归一化法归一化法是将所有组分的峰面积A分别乘以它们的相对校正因子后求和，即所谓"归一"，被测组分X的含量可以用下式求得:    采用归一化法进展定量分析的前提

32、条件是样品中所有成分都要能从色谱柱上洗脱下来，并能被检测器检测。归一法主要在气相色谱中应用。3. 外标法直接比较法：将未知样品中某一物质的峰面积与该物质的标准品的峰面积直接比较进展定量。通常要求标准品的浓度与被测组分浓度接近，以减小定量误差。标准曲线法：将被测组分的标准物质配制成不同浓度的标准溶液，经色谱分析后制作一条标准曲线，即物质浓度与其峰面积或峰高的关系曲线。根据样品中待测组分的色谱峰面积或峰高，从标准曲线上查得相应的浓度。标准曲线的斜率与物质的性质和检测器的特性相关，相当于待测组分的校正因子。4. 内标法内标法是将浓度的标准物质内标物参加到未知样品中去，然后比较内标物和被测组分的峰面积，从而确定被测组分的浓度。由于内标物和被测组分处在同一基体中，因此可以消除基体带来的干扰。而且当仪器参数和洗脱条件发生非人为的变化时，内标物和样品组分都会受到同样影响，这样消除了系统误差。当对样品的情况不了解、样品的基体很复杂或不需要测定样品中所有组分时，采用这种方法比较适宜。内标物应满足的要求：·在所给定的色谱