第二章-细胞的分离及破碎-1

1、预处理预处理-细胞的分离与破碎细胞的分离与破碎 2.1 2.1 细胞分离细胞分离 重力沉降重力沉降 离心沉降离心沉降 过滤过滤 重力沉降重力沉降 重力沉降是化工过程中常用的气固、液固和液液分离手段，在生化分离过程中亦有一定程度的应用。以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受到重力、浮力和摩擦阻力的作用。考虑球形的固体颗粒，则当浮力、摩擦阻力和重力达到平衡时，固体颗粒匀速沉降，沉降速度为 上式为球形粒子的Stokes沉降速度， 、 、和 分别表示粒径、固体颗粒密度、液体密度和重力加速度， 为重力沉降速度， 为液体粘度。 LLSpggd18)(2pdsLggL 菌体和动植物细胞的重力沉降虽然简便易

2、行，但菌体细胞体积很小，沉降速度很慢。因此，实用上需使菌体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后进行沉降操作，提高沉降速度。 离心沉降离心沉降 离心类别 离心沉降速度 离心分离法 离心分离设备 离心机的种类和适用范离心机的种类和适用范围围 低低速速离离心心机机 高高速速离离心心机机 超超离离心心机机 转转速速 / rpm 2 0006 000 10 00026 000 30000120000 离离心心力力 / g 2 0007 000 8 00080 000 100000600000 细 胞 适用 适用 适用 细胞核 适用 适用 适用 细胞器 适用 适用 适适用用范范围围 蛋白质 适用 离心沉降速度 离心

3、设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量离心程度的参数，用Z表示 式中，r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距离，N为离心机的转数(s-1) 。grNZ224离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs为 或LLSPsrNd9)(2222SrdtdrsN.2离心分离法 差速离心 区带离心 差速离心分级差速离心(Differential centrifugation)是生化工业中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作的一种特殊情况，即为一级分级分离。1. 操作

4、中，根据实际物料的特点(目标产物和其他组分的性质和相互作用等)、分离的目的和所需分离的程度，选择适当的操作条件(离心转数和时间)，可使料液中的不同组分得到分级分离。 差差速速离离心心 差速离心是生化工业中常用离心分离方法。以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离，是分级离心操作的一种特殊情况，即为一级分级分离。2.2.3.2 离心分离法离心分离法主要菌体和细胞的离心分离主要菌体和细胞的离心分离离离心心力力 菌菌体体、细细胞胞 大大小小/m 实实验验室室 工工业业规规模模 大肠杆菌 24 1 500g 13 000g 酵母 27 1 500g 8 000g 血小板 24 5 000g 红血球

5、69 1 200g 淋巴球 712 500g 肝细胞 2030 800g 蛋白质的沉降系数蛋白质的沉降系数区带离心 区带离心(Zonal centrifugation)是生化研究中的重要分离手段，根据离心操作条件不同，分为差速区带离心(Rate zonal density gradient sedimentation)1. 平衡区带离心(Isopycnic density gradient sedimentation) 梯度梯度离心离心两种区带离心法均事先在离心管中用某种低分子溶质(如蔗糖、甘油等溶液)调配好密度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液后进行离心操作。区带离心的密度梯度一般可用蔗糖配

6、制。事先调配不同浓度(密度)的蔗糖溶液，然后在离心管中依浓度从大到小层层加入即可。将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速离心后可制成连续的蔗糖密度梯度。 区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限于实验室水平。 密度梯度离心（密度梯度离心（density gradient） 生物大分子及颗粒的沉降不仅生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密

7、度相等的质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有步收集。常用的介质有蔗糖蔗糖、氯氯化铯等。化铯等。滴加样品滴加样品蔗糖浓度蔗糖浓度离离心心管管蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用1、核酸密度的测定、核酸密度的测定 = o + 4.2 2( 2- 02) 10-102、测定、测定DNA中中G-C之含量之含量

8、Rolfe-Meselson公式：公式： = 0.100 xG-C + 1.6583、溶液中核酸构象的研究、溶液中核酸构象的研究 ：单链：单链DNA 双链双链DNA 蛋白质蛋白质 双链双链DNA RNA4、核酸的制备、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心氯化铯密度梯度超离心经染料经染料-氯化铯密度梯氯化铯密度梯度超离心后，质粒度超离心后，质粒DNA及各种杂质的分布及各种杂质的分布超螺旋超螺旋DNA闭环质粒闭环质粒DNA开环质及开环质及线型线型DNA蛋白质蛋白质石蜡油石蜡油离心分离设备 离心机是生化实验室及生化工业广泛使用的分离设备。实验室用离心机以离心管式转子离心机为主，离心操作为间歇式。 1.

9、工业离心分离设备中，较为常用的有管式和碟片式两大类。 管式管式离心机碟片式碟片式离心机各种转子各种转子区带转子分析转子过滤过滤 过滤速度 过滤设备 过滤操作过滤操作= 织物状介质织物状介质，棉花、石棉、蚕丝、麻、羊毛及各种人造纤维与金属丝等= 多孔陶瓷介质多孔陶瓷介质，此为特殊的介质，低温烧制，具有大量微细孔道的滤管或滤板（其他多孔材料，PE等）= 膜分离介质，膜分离介质，微滤分离等 采用合适的多孔性过滤介质，可以过滤截留菌体、细胞和碎片等悬浮液中的固体离子。2.2.2 过滤过滤 对具体过滤处理的不同对象，应根据下列因素，选取合适的过滤设备：(1)料液的粘度、腐蚀性；(2)固态悬浮物的粒度、浓

10、度以及变形性等；(3)目的产物是液体部分还是悬浮固体等。 过滤速度过滤操作一般以压力差为透过推动力，只靠重力不能达到足够大的透过速度。过滤操作中固形成分被过滤介质截留，在介质表面形成滤饼。滤液的透过阻力来自两个方面，即过滤介质和介质表面不断堆积的滤饼。1. 提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。由于滤饼阻力是影响过滤速度的主要因素，因此在过滤操作以前，一般要对滤液进行絮凝或凝聚等预处理。改变料液的性质，降低滤饼的阻力。 过滤设备 内装微孔滤膜 进液口出液口微孔滤膜滤器微孔滤膜滤器2.2.2.3 常用过滤设备常用过滤设备 生化分离中，工业规模过滤设备主要有加压叶滤机、板框过生化分离中，工业规模

11、过滤设备主要有加压叶滤机、板框过滤机、旋转真空过滤机。滤机、旋转真空过滤机。过滤板滤框洗涤板板框式压滤机装置及滤板与滤框的构造板框式压滤机装置及滤板与滤框的构造 1钮2钮3钮加压叶滤机加压叶滤机 加压叶滤机占地面积小，单位容积过滤面积大。相对于板框过滤机，叶滤机在密封条件下过滤，适于；但需要足够的空间来更换滤叶和清除滤饼，发酵工厂中常用于啤酒过滤，即垂直叶片硅藻土过滤机。 板框式过滤机：适用于要求滤饼较干的场合，不适用于含挥发性有毒物质或有生物危害的场合。 思考题思考题1、何谓沉降、何谓沉降2、沉降与离心的异同、沉降与离心的异同3、离心设备可分为哪两大类、离心设备可分为哪两大类4、常用的离心沉

12、降设备有哪些、常用的离心沉降设备有哪些5、常用的离心过滤设备有哪些、常用的离心过滤设备有哪些2.2 细胞破碎细胞破碎 生物产物可能存在于细胞壁、细胞膜、细胞质以及线粒体、核糖体、内质网和高尔基体等细胞器中。就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物。 胞外产物：胞外产物：微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接进行固液分离，即可进行滤清液的分离。 胞内产物：胞内产物： 某些目的产物不能分泌到细胞外，留在细胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等。 随着重组DNA技术发展，许多有重要价值的生物产品应运而生，如胰岛素、

13、干扰素、白细胞介素-2等，基因在宿主细胞内克隆表达成为基因工程产品，其中许多存在于胞内。 分离，使产物得以释放，才能进一步提取。 细胞的结构细胞的结构细菌细胞外层结构细菌细胞外层结构 细胞破碎法细胞破碎法 机械破碎 化学和生物化学渗透 物理渗透法 细胞破碎和产物释放原理细胞破碎和产物释放原理 胞内产物释放速率模型 机械破碎 高压匀浆 珠磨 撞击破碎 超声波破碎机械破碎机械破碎机械破碎处理量大、破碎效率高、速度快，是工业规模细胞破碎的主要手段。细胞破碎器与传统的机械破碎设备的操作原理相同，主要基于对物料的挤压和剪切作用。根据细胞为弹性体、直径小、破碎难度大和以回收胞内产物为目的、需低温操作等特点

14、，细胞破碎器采用了特殊的结构设计。细胞的机械破碎主要有。 高压匀浆高压匀浆高压匀浆又称高压剪切破碎。高压匀浆器的破碎原理是：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀杆之间的环隙高速(可达到450m/s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常为50-70MPa。 生产型高压均质细胞破碎机生产型高压均质细胞破碎机 ： 细胞破碎仪有一个数个往复运动的柱塞，物料在柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中，经过特定宽度的限流缝隙（工作区）后，瞬间失压的物料以极高的流速（1000-1500米/秒）喷出，碰撞在碰撞阀组件之一的冲

15、击环上，产生三种效应：空穴效应、撞击效应、剪切效应。经过这三种效应处理过后，物料粒径可均匀细化到100nm以下，破碎率大于95%！ 高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机高压匀浆法中影响细胞破碎的因素主要有压力、循环操作次数和温度。细胞破碎率S与操作压力P和循环操作次数N之间的关系可表达为细胞破碎率用胞内产物释放率表示,是单位质量细胞的产物释放量，mg/cell baNkpS11lnmaxRRS 高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20左右。团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，一般不宜使用高压匀浆法。高压匀浆操作的温度上升约2 310

16、MPa，为保护目标产物的生物活性，需对料液作冷却处理，多级破碎操作中需在级间设置冷却装置。因为料液通过匀浆器的时间很短，通过匀浆器后迅速冷却，可有效防止温度上升，保护产物活性。 水平搅拌式珠磨机水平搅拌式珠磨机 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃珠、石英砂、氧化锆等研磨剂(直径1mm一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切剪切、碰撞碰撞，使细胞受到研磨剪切和撞击而破碎破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量采用换热冷却带走。 珠磨法珠磨法(Bead mill) 珠磨机连续操作时，兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活

17、的可能性。 珠磨法的破碎效果，与珠体直径珠体直径、装珠量装珠量、细胞细胞浓度浓度、料液性质料液性质、搅拌器转速搅拌器转速与构型构型、操作温度温度等参数有关。 珠磨机的种类很多，处理规模跨度很宽，从实验规模的组织捣碎机，到工业规模的高速珠磨机。 如WAB公司的Dyno Mill KD45C型最大搅拌速度为1450rpm(圆周线速度20m/s)，破碎室体积45L。 珠磨法破碎操作时，产生大量的热能。但有效能量利用率仅为1左右。在设计操作时应充分考虑换热能力问题。 珠磨法(Bead milling)破碎细胞可采用间歇或连续操作。两种情况下细胞的破碎动力学均可近似表示 其中k为破碎速率常数t在间歇操作

18、时为破碎操作时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间 ktS11lnQVt 喷雾撞击法喷雾撞击法 细胞是弹性体，比一般的刚性固体例子难于破碎。将细胞冷冻使其成为刚性球体，降低破碎的难度。喷雾撞击破碎正是基于这样的原理。 如下图，细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为每分钟数千 ），形成粒径小于50微米的微粒子。高速载气(如N2，流速为300m/s)将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。喷雾撞击破碎的结构喷雾撞击破碎的结构 与珠磨法和高压均质法相比， 本方法中，细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的瞬间，细胞破碎程度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象 细胞破

19、碎程度可通过无级调节载气压力（流速）控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器（线粒体、叶绿体等）的回收。 喷雾撞击破碎适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎，通常处理细胞悬浮液质量浓度为100200g/L。实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力约50500mL，而工业规模的连续处理能力在10L/h以上。 针对目标产物的性质（如相对分子质量、 分子形态、稳定性等），选择合适的细胞破碎法，并确定适宜的破碎操作条件是非常重要的。 如核酸相对分子质量很大，破碎中易受剪切损伤。 利用高压均质、珠磨、超声波和喷雾破碎等数种机械破碎器破碎大肠杆菌，提取质粒DNA的研究表明，只有珠磨法的完整质粒收率在90以上，

20、而其他方法的收率低于50。 超声波破碎超声波破碎 超声波破碎法(Ultrasonication)利用发射1525kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。1. 超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用空化作用(cavitation)，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。 JY92-II D超声波超声波细胞破碎机细胞破碎机 S-250D数码式数码式超声波细胞破碎仪超声波细胞破碎仪化学和生物化学法 酸、碱处理酸、碱处理 蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，使蛋白质之

21、间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶解。因此，利用酸碱调节pH值，可提高目标产物溶解度 。化学试剂处理化学试剂处理 用表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，Triton X-100等)、螯合剂(如乙二胺四乙酸，简称EDTA)、盐(改变离子强度)或有机溶剂(苯、甲苯等)处理细胞，可增大细胞壁通透性。脲(urea)和盐酸胍(guanidine HCl)等变性剂(chaotropic agent)能破坏氢键作用，降低胞内产物之间的相互作用，使之容易释放。 酶溶酶溶 酶溶法(Enzymatic lysis)利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞

22、膜，进一步增大胞内产物的通透性。 溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁；酵母细胞的酶溶需用Zymolyase(几种细菌酶的混合物)、-1,6葡聚糖酶(-1，6-dextranase)或甘露糖酶(mannanase)；破坏植物细胞壁需用纤维素酶(cellulase)。 化学渗透法比机械破碎速度低，效率差，并且化学或生化试剂的添加形成新的污染，给进一步的分离纯化增添麻烦。但是，化学渗透法比机械破碎的选择性高，胞内产物的总释放率低，特别是可有效地抑制核酸的释放，料液粘度小，有利于后处理过程。 物理渗透法 渗透压冲击法

23、冻结融化法渗透压冲击法 渗透压冲击(Osmotic shock)是在各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。将细胞置于高渗透压的介质(如较高浓度的甘油或蔗糖溶液)中，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中。在渗透压的作用下，水渗透通过细胞壁和膜进入细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。 结-化法 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性。另一方面，由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。冻结-融化法对于存在于细胞质周

24、围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效。 2.1.2 细胞破碎原理细胞破碎原理 细胞破碎方法可分成两大类，一是机械法机械法，二是非机械非机械法法，或是两者的结合。 机械法（机械法（主要有压缩力压缩力和剪切力）剪切力）有珠磨法、高压均质法、超声破碎法、X-press法等；由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，大多需冷却以防止生物品受热破坏。 非机械法非机械法有酶溶法、化学法、物理法等。 化学破碎利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶解速率；或者完全溶解细胞壁后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。 由于细胞之间以及目标产物之间的性质差别很大，需通过实验确定适宜的破碎器

25、和破碎操作条件，获得最佳的破碎效率。提高破碎率意味着延长破碎操作时间或增加破碎操作次数，后者往往引起目标物的变性或失活。过渡的破碎释放大量的胞内产物，给下游的分离纯化操作增加难度。因此，破碎应与整个下游加工过程相联系，在保证目标产物有较高收率的前提下，使下游加工过程的成本降低。一般原则一般原则 (1) 仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围 当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较温和的方法，如酶溶法(包括自溶法)、渗透压冲击法和冻结融化法等。 当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法。选择性释放胞内产物流程选择性释放胞内产物流程 (2) 选择性溶解目标产物选择性溶解目标产物 当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调整溶液pH值、离子强度或添加与目标产物有亲和性的试剂如螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。同时，溶液性质应使其