生物制药工艺学：第七、八章 凝胶层析与膜分离技术

1、1凝胶层析是利用凝胶分子筛孔径，根据生物分子大小和形状不同的分子进行的层析 。凝胶过滤分子筛层析排阻层析凝胶渗透层析。 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。第七章 凝胶层析2一、原理：一、原理：大小不同的样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子运动路程长，且受到凝胶珠内部的阻力也很大，故越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。 凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。第一节第一节 凝胶层析的基本原理凝胶层析的基本原理

2、34二、凝胶层析的特点u操作简便、设备简单(仅需一根层析柱)、凝胶不需再生。u分离效果好、重复性高、样品回收率高,接近100%。u分离条件缓和，对分离物的活性无不良影响。u应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化，脱盐、浓缩以及分析测定类。凝胶层析的优点：凝胶层析的优点：u分辨率不高，分离操作较慢；u分离制备量小。凝胶层析的缺点凝胶层析的缺点：5外水体积外水体积（V V0 0）：）：峰洗脱体积峰洗脱体积Ve ： 色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，常常用用V V0 0表示。表示。 是指被分离物质通过凝胶柱所需洗

3、脱液的体积，常是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用用VeVe 表示。表示。内水体积（内水体积（Vi） ： 液体进入颗粒内部的总和为内水体积，又称定相液体进入颗粒内部的总和为内水体积，又称定相体体积，常用积，常用ViVi表示。表示。柱体积柱体积(Vt) ： 从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。又称从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。又称“床床”体体积积(V(Vt t) )。三、凝胶层析的重要参数三、凝胶层析的重要参数基质体积（基质体积（Vg）：）： 凝胶颗粒实际骨架体积，称作基质体积，常用凝胶颗粒实际骨架体积，称作基质体积，常用（VgVg）表示。表示。1 1、几个基本概念、几个基本概念6三、凝

4、胶层析的重要参数三、凝胶层析的重要参数7 VeVe -Vo-Vo Kd Kd = = Vi Vi2 2、分配系数（、分配系数（ KdKd ）：）：8 KdKd = 1 = 1，VeVe = Vo + Vi = Vo + Vi分子完全不被排阻分子完全不被排阻在两相分配的比值为在两相分配的比值为1, 1,最后流出最后流出. .KdKd = 0 = 0， VeVe = Vo = Vo分子完全被排阻于凝分子完全被排阻于凝胶颗粒之外胶颗粒之外全部分布于流动相里全部分布于流动相里, ,最先流出。最先流出。 0 Kd 0 Kd 1 1m1m压力差压力差微孔过滤微孔过滤0.01-1 m0.01-1 m压力差压

5、力差透析透析5-1005-100分子扩散分子扩散超级过滤超级过滤5-1005-100压力差压力差反渗透反渗透55压力差压力差电渗析电渗析55电能电能各各 种种 膜膜 分分 离离 范范 围围40截截 留留 分分 子子 量量 范范 围：围：41 反渗透（反渗透（Reverse osmosis，RO） 纳滤（纳滤（Nanofiltration，NF） 超滤（超滤（Ultrafiltration，UF） 微滤（微滤（Microfiltration，MF）动漫原理动漫原理42特点（优势）特点（优势）43第一节第一节 透析透析蛋白质、无机盐蛋白质、无机盐 无机盐无机盐缓冲液缓冲液 透析是采用半透膜作为滤膜

6、透析是采用半透膜作为滤膜,使试样中的小分子经扩散使试样中的小分子经扩散作用不断透出膜外作用不断透出膜外,而大分子不能透过被保留在透析袋内，而大分子不能透过被保留在透析袋内，从而达到大小分子分离的一种膜过滤方法。从而达到大小分子分离的一种膜过滤方法。 0.5-10nm，3000 几万几万D441.1.透析和超滤透析和超滤半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力搅拌器磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：等分开。常用的

7、半透膜： 玻璃纸（赛璐玢纸，玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper） 火绵纸（赛璐玎纸火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper） 其他改型纤维素材料其他改型纤维素材料45超过滤（超过滤（ultrafiltration） 利用压力、抽滤（利用压力、抽滤（A）或离）或离心力（心力（B）等多种形式，强行使）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。相对分子量不同的蛋白质。

8、为了避免被膜截留的蛋白质为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用在膜表面上堆积，现常用截向截向流过滤流过滤的方法，即液体在泵驱的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。蛋白质分子冲走。滤膜滤膜抽气抽气滤膜滤膜离心离心AB46用于除去蛋白或核酸样品中的盐、等小分用于除去蛋白或核酸样品中的盐、等小分子物质。子物质。由于透析过程以由于透析过程以浓差浓差为传质推动力，膜的透为传质推动力，膜的透过通

9、量很小，不适于大规模生物分离过程，过通量很小，不适于大规模生物分离过程，而在实验室中应用较多。而在实验室中应用较多。 透透 析析 的的 应应 用用47 透析法在临床上常用于肾衰竭患者的血液透析。透析法在临床上常用于肾衰竭患者的血液透析。48u 透析材料：透析材料：兽类的膀胱、硝酸纤维素膜、玻璃玻璃纸纸。l人工透析膜多为纤维素的衍生物。u 用于透析的半透膜应具备的条件：用于透析的半透膜应具备的条件：l在溶剂中能形成分子筛状多孔薄膜，只允许小分子溶质通过，而阻止大分子（如蛋白质）通过；l化学惰性；在水、盐溶液、稀酸或稀碱溶液中稳定；l良好的物理性能：有一定的机械强度和良好的再生性能透透 析析 膜膜

10、49u 透析袋透析袋预处理：预处理：用用50%50%乙醇慢慢煮沸一小时，再分别用乙醇慢慢煮沸一小时，再分别用50%50%乙醇、乙醇、0.01mol/L0.01mol/L碳酸氢纳溶液、碳酸氢纳溶液、0.001 mol/L EDTA 0.001 mol/L EDTA 溶液依次洗涤，溶液依次洗涤，最后用蒸馏水洗涤三次；最后用蒸馏水洗涤三次；u 透析前，对装有试液的透析袋检查是否有泄漏；透析前，对装有试液的透析袋检查是否有泄漏；u 透析袋装一半左右，防止膜外溶剂因浓度差渗入将袋涨裂或过透析袋装一半左右，防止膜外溶剂因浓度差渗入将袋涨裂或过度膨胀使膜孔径改变；度膨胀使膜孔径改变；u 袋要扎紧以防流失。袋

11、要扎紧以防流失。u 搅拌；定期或连续更换外部溶剂可提高透析效果。搅拌；定期或连续更换外部溶剂可提高透析效果。u 透析袋的保存透析袋的保存：短时间，储存于：短时间，储存于44蒸馏水中，蒸馏水中， 长时间，洗净长时间，洗净后置于甘油中（防菌）后置于甘油中（防菌）透析过程注意点透析过程注意点50 定义：定义：超过滤超过滤( (简称超滤简称超滤) )是一项是一项分子级分子级膜分离手膜分离手段，以段，以压力差压力差为推动力将不同分子量的物质进行选为推动力将不同分子量的物质进行选择性分离。择性分离。 一般用于液相分离。一般用于液相分离。 5152超滤技术的优点超滤技术的优点1. 超滤过程是在常温下进行，条

12、件温和无成分破坏，因而特别适宜对热敏感的物质的分离、分级、浓缩与富集。2. 滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无污染，是一种节能环保的分离技术。3. 对稀溶液中的微量成分的回收、浓缩非常有效。4. 超滤过程仅采用压力作为膜分离的动力，分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护。53超滤膜的选用超滤膜的选用分子量截留分子量截留值：值： 阻留率阻留率达达90%以上以上的最小被截的最小被截留物质的分留物质的分子量。子量。54超滤过程和装置超滤过程和装置l 外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜，大分子被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度，这就是浓差极化现象。l 错流过滤打破了浓

13、差极化现象，即液体的流向和滤膜相切，使得滤膜的孔隙不容易堵塞。 （一）浓差极化现象（一）浓差极化现象错流过滤错流过滤55u无搅拌式超滤：无搅拌式超滤：这种装置比较简单，只是在密闭的容器中施加一定压力，使小分子和溶剂分子挤压出膜外，无搅拌装置浓度极化较为严重，只适合于浓度较稀的小量超滤。（二）超二）超 滤滤 器器56u 搅拌式超滤搅拌式超滤是将超滤装置加磁力搅拌器，小分子溶质和溶剂分子被排出膜外，大分子向滤膜表面堆积时，被电磁搅拌器分散到溶液中。这种方法不容易产生浓度极化现象，提高了超滤的速度。57u中空纤维超滤中空纤维超滤 中空纤维超滤是在一支空心柱内装有许多的，中空纤维毛细管，两端相通，管的

14、像一个微型透析袋，极大地增大了渗透的表面积，提高了超滤的速度。58（三）超滤的操作和应用（三）超滤的操作和应用u超滤膜和超滤器的处理超滤膜和超滤器的处理l超滤膜不能干燥和受污染；l洗净，除菌；l操作正确可用1-2年，暂时不用时，保存于30%甘油甲醛等溶液中；u过滤操作过滤操作l洗去保养液超滤洗涤保养59 浓缩和脱盐 分级分离和纯化 除去热源，如产品分子量1000以下，可用截留分子量1万左右的膜比较合适。（四）超滤技术的应用（四）超滤技术的应用60 以多孔薄膜为过滤介质，压力差为推动力，利用筛分原理使不溶性粒子（0.1-10um）得以分离的操作。操作压力0.05-0.5MPa。61l 设备简单l 操作简便、快速l 分辨率高、重现性好一、微孔膜的特点和应用范围一、微孔膜的特点和应用范围u特点：特点：l0.01-0.05m：噬菌体、病毒或大的胶体颗粒。l0.1m：试剂的超净、分离沉淀和胶体悬液。l0.2m：高纯水的制备、制剂除菌、细菌计数、空气病毒定量测定等。l0.45m：水的超净化处理、色谱分析时流动相的处理、。 u应用范围：应