生物制品：抗体药物

1、抗体药物抗体药物第一节第一节 概述概述第二第二节节 抗毒素与免疫血清抗毒素与免疫血清第三节第三节 单克隆抗体单克隆抗体第四第四节节 基因工程抗体基因工程抗体第一节第一节 概述概述抗体药物的概念抗体药物的概念抗体抗体机体在抗原性物质的刺激下所产生的一种免疫机体在抗原性物质的刺激下所产生的一种免疫球蛋白球蛋白(主要由淋巴细胞所产生主要由淋巴细胞所产生)，因其能与细菌、病毒，因其能与细菌、病毒或毒素等异源性物质结合而发挥预防、治疗疾病作用。或毒素等异源性物质结合而发挥预防、治疗疾病作用。药物药物(drug)：是一类分子（化学合成物，蛋白质，核酸：是一类分子（化学合成物，蛋白质，核酸等）可以干扰人体内

2、细胞生命过程中一些重要的生理和等）可以干扰人体内细胞生命过程中一些重要的生理和病理活动或通路病理活动或通路抗体类药物以其高特异性、有效性和安全性正在发展成抗体类药物以其高特异性、有效性和安全性正在发展成为国际药品市场上一大类新型诊断和治疗剂。为国际药品市场上一大类新型诊断和治疗剂。Antibody has a higher specificity and affinity to bind to target protein. 抗体技术的发展抗体技术的发展多克隆抗体多克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体基因工程抗体多克隆抗体多克隆抗体1890年，德国人年，德国人Behring（培林）和（培林

3、）和日本人日本人Kitasato(北里）将白喉外毒素北里）将白喉外毒素注射给动物，发现在该动物血清中存注射给动物，发现在该动物血清中存在一种能中和白喉外毒素的物质，他在一种能中和白喉外毒素的物质，他们称之为抗毒素。将具有抗毒素的免们称之为抗毒素。将具有抗毒素的免疫血清注入正常动物体内，可使其获疫血清注入正常动物体内，可使其获得对白喉毒素的抵抗力。他们以同样得对白喉毒素的抵抗力。他们以同样的方法用这种免疫血清成功地治愈了的方法用这种免疫血清成功地治愈了一例患白喉病的女孩。一例患白喉病的女孩。1901年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖单克隆抗体单克隆抗体1975年，英国剑桥的科学家年，英国剑桥的科学家Koh

4、ler和和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞核经绵阳红细胞将小鼠骨髓瘤细胞核经绵阳红细胞免疫过的小鼠脾细胞在体外进行细胞融合，免疫过的小鼠脾细胞在体外进行细胞融合，采用合适的培养基进行培养，结果发现，采用合适的培养基进行培养，结果发现，部分杂家细胞既能继续在体外培养条件下部分杂家细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖，有能分泌抗体，他们称这种杂生长繁殖，有能分泌抗体，他们称这种杂交细胞系为杂交瘤。交细胞系为杂交瘤。应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体。克隆抗体。这种方法制备的单克隆抗体可视为第二代这种方法制备的单克隆抗体可视为第二代抗体。抗体。基因工程抗

5、体基因工程抗体基因工程抗体兴起于基因工程抗体兴起于20世纪世纪80年代早期。这年代早期。这一技术是在充分了解一技术是在充分了解Ig基因结构与功能的基基因结构与功能的基础上与础上与DNA重组技术相结合，然后根据研究重组技术相结合，然后根据研究者的意图，在基因水平上对者的意图，在基因水平上对Ig分子进行剪切、分子进行剪切、连接或修饰，甚至是人工合成后导入受体细连接或修饰，甚至是人工合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体，也称为第三代抗体。胞表达，产生新型抗体，也称为第三代抗体。嵌合抗体、改型抗体、单链抗体、单区抗体、嵌合抗体、改型抗体、单链抗体、单区抗体、抗体库抗体库7576777879808182

6、838485868788899091929394959697989920001 12 23 34 45 56 67 71.1.单克隆抗体单克隆抗体- -杂交瘤技术宣告诞生杂交瘤技术宣告诞生图图1.治疗性抗体发展历程和事件治疗性抗体发展历程和事件 2.2.应用抗体治疗淋巴瘤取得成功应用抗体治疗淋巴瘤取得成功3. OKT3单抗被美国单抗被美国FDA批准上市批准上市4. 单抗用于肿瘤治疗效果不佳单抗用于肿瘤治疗效果不佳 5.5.抗内毒素单抗试用于治疗败血症性休克失败抗内毒素单抗试用于治疗败血症性休克失败6. 6. 抗抗17-1A17-1A和和ReoProReoPro上市上市7. FDA批准批准21个

7、治疗性单抗上市个治疗性单抗上市 2010年治疗性单抗类药物市场份额为480亿美元,相比于2008年的370亿美元和2009年的400亿美元,稳步提高.另外用于诊断和作为试剂用途的单抗类产品销售额为100亿美元。预计到2014年全球抗体药物的年销售将达到1000亿美元。http:/ NameGenetic Name商品名商品名FDAFDA批准批准上市时间上市时间适应症适应症生产厂家生产厂家销售额销售额 ( (亿亿 美元美元) )20092009201020101 1InfliximabInfliximabRemicadeRemicade19981998RA, UC, CD, Ps, PsA, R

8、A, UC, CD, Ps, PsA, AS AS J&J, Merck, Mitsubishi J&J, Merck, Mitsubishi TanabeTanabe69.169.180802 2BevacizumabBevacizumabAvastinAvastin20042004Colon cancerColon cancerRocheRoche59.259.268683 3RituximabRituximabRituxanRituxan19971997NHL, RANHL, RARocheRoche585867674 4AdalimumabAdalimumabHumir

9、a Humira 20022002RA, Ps, JIA, PsA, AS, RA, Ps, JIA, PsA, AS, CD CD AbbottAbbott54.954.965655 5TrastuzumabTrastuzumabHerceptin Herceptin 19981998Breast CancerBreast CancerRocheRoche50.250.255556 6CetuximabCetuximabErbituxErbitux20042004Colon, head and neck Colon, head and neck cancercancerBristol Mye

10、rs Squibb, Bristol Myers Squibb, Merck Serono Merck Serono 25.725.732327 7Ranibizumab hzRanibizumab hzLucentisLucentis20062006Wet Macular Wet Macular degeneration degeneration Novartis, RocheNovartis, Roche24.324.331318 8NatalizumabNatalizumabTysabri Tysabri 2004/20062004/2006Multiple sclerosisMulti

11、ple sclerosisBiogen Idec, ElanBiogen Idec, Elan10.610.617.517.59 9Omalizumab hz Omalizumab hz Xolair Xolair 20032003Allergic AsthmaAllergic AsthmaRoche, NovartisRoche, Novartis9.19.111111010PalivizumabPalivizumabSynagisSynagis19981998RSVRSVAstra ZenecaAstra Zeneca11111010在未来在未来十年内十年内，很多全球，很多全球销售额达到销

12、售额达到500500亿亿美元的生物制品面临仿制药的竞争美元的生物制品面临仿制药的竞争 迄今为止，我国共批准了15 个抗体药物上市，7 种为进口，8 种为自主研发。 差距：技术与资金，单克隆抗体药还未进入医保目录。 生物制药占比远低于世界水平，发展空间巨大。2007 年全球抗体药物已占整个生物技术药物市场份额的34.4%，而我国仅为1.7%，远低于全球平均水平。 这一方面说明了我国抗体药物市场的落后，另一方面也提示了我国市场巨大的潜力。以上市时间较早的利妥昔和曲妥珠单抗为例，两者2003 年在样本医院的销售额仅为0.177 亿元和0.027 亿元，而2008年销售额已上升至2.12 亿元和1.1

13、4 亿元，20032008 年复合增速高达64%和111%，远高于总药品18%的复合增速。 预计到2015年，我国抗体药物市场规模将达137亿元。单抗药物国内发展现状单抗药物国内发展现状单抗药物国内销售额单抗药物国内销售额商品名商品名生产厂家生产厂家适应症适应症20112011年销售额年销售额 ( (亿元人民币亿元人民币) )20112011年增长率年增长率（% %）1 1Mabthera 美罗华美国罗氏淋巴瘤4.94232 2Herceptin 赫塞汀美国罗氏乳腺癌4.17373 3Yi Sai Pu 益赛普中信国健类风湿关节炎、强直性脊柱炎和银屑病2.7264 4Tai Xin Sheng

14、 泰欣生百泰生物颈部肿瘤、消化道肿瘤1.38275 5Remicade 英利昔單抗西安杨森类风湿关节炎1.08286 6Avastin 阿瓦斯汀美国罗氏结直肠癌0.7-7 7Simulect 舒萊诺华制药器官移植的抗排斥治疗0.548 8Enbrel 恩博辉瑞制药类风湿关节炎0.228 利卡汀：成都华神，治疗肝癌 唯美生：上海美恩，治疗肺癌 抗CD3单抗：武汉生物所，用于器官移植的抗排斥治疗 恩博克： 宏远逸士生物技术药业有限公司，治疗牛皮癣 Muromonab-CD3： 奥多生物技术，用于器官移植的抗排斥治疗 赛尼哌：美国罗氏，用于器官移植的抗排斥治疗 爱必妥： 默克，治疗结直肠癌 来自政策

15、的扶持：随着医疗改革的推进，政府在公共医疗卫生领域的投入会增大，政策扶持力度将加大，单抗药物的研发和产业将会受益。 目前，国内正兴起新一轮抗体药物投资。据悉，全国各地至少建了三四十条生产线，而每一条投资至少12亿美元。 未来几年国内单抗药有望实现爆发式增长，增长率预计超过50%，10年后，国内市场规模有望达到目前国际水平。目前我国正处于抗体药物快速发展的起步阶段，未来几年，单抗药物将成为生物制药发展重点。 我国单抗发展的重点：防治恶性肿瘤、心脑血管疾病、神经系统疾病、消化系统疾病、艾滋病以及免疫缺陷等疾病的抗体药物；抗体人源化及人源抗体；提高大规模细胞培养和蛋白纯化技术。国内单抗药物发展展望国

16、内单抗药物发展展望中国中国SFDA批准上市和进入临床的抗体药物批准上市和进入临床的抗体药物抗体名称抗体名称商品名商品名厂家厂家抗体类型抗体类型研发阶段研发阶段适应症适应症Muromonab-CD3Orthoclone奥多生物技术公司奥多生物技术公司（Ortho Biotech）鼠源鼠源批准上市批准上市抑制排斥反应抑制排斥反应Rituximab利妥昔利妥昔罗氏（罗氏（Roche）公）公司司嵌合嵌合批准上市批准上市治疗非何杰金淋巴治疗非何杰金淋巴瘤瘤Trastuzumab和曲妥珠和曲妥珠罗氏（罗氏（Roche）公）公司司人源化人源化批准上市批准上市治疗乳腺癌治疗乳腺癌Basiliximab巴利昔巴

17、利昔诺华制药诺华制药（Novartis）嵌合嵌合批准上市批准上市各种器官移植的抗各种器官移植的抗排斥治疗，尤其在排斥治疗，尤其在对肾移植后急性排对肾移植后急性排斥反应的治疗斥反应的治疗Trastuzumab贺塞汀贺塞汀基因工程技术公司基因工程技术公司（Genentech）人源化人源化批准上市批准上市注射用鼠源性抗注射用鼠源性抗人人T淋巴细胞淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体抗原单克隆抗体 武汉生物制品研究武汉生物制品研究所所 鼠源鼠源批准上市批准上市抗肾移植单抗抗肾移植单抗OKT3 抗人抗人IL-8单克隆单克隆抗体乳膏抗体乳膏 东莞宏远逸士生物东莞宏远逸士生物技术药业有限公司技术药业有限公司 鼠源鼠

18、源批准上市批准上市牛皮癣的治疗牛皮癣的治疗 碘碘131I人鼠嵌人鼠嵌合型肿瘤细胞核合型肿瘤细胞核单克隆抗体注射单克隆抗体注射液（液（131I-chTNT） 上海美恩生物技术上海美恩生物技术有限公司有限公司 嵌合嵌合批准上市批准上市国家国家类新药类新药 ，用用于多种实体瘤于多种实体瘤 中国中国SFDA批准上市和进入临床的抗体药物批准上市和进入临床的抗体药物抗体名称抗体名称商品名商品名厂家厂家抗体类型抗体类型研发阶段研发阶段适应症适应症碘碘131I肝癌片肝癌片段抗体注射液段抗体注射液 美妥昔美妥昔第四军医大学第四军医大学 成都华神集团成都华神集团鼠源鼠源完成临床完成临床待批上市待批上市用于原发性肝

19、用于原发性肝癌的靶向治疗癌的靶向治疗 H-R3 北京百泰生物药业北京百泰生物药业公司公司 人源化人源化 期临床期临床 实体瘤治疗实体瘤治疗 注射用鼠抗人注射用鼠抗人T淋淋巴细胞巴细胞CD3表面抗表面抗原单克隆抗体原单克隆抗体 济南天康生物制品济南天康生物制品有限公司有限公司 鼠源鼠源临床研究临床研究抗移植排斥抗移植排斥 注射用抗肾病综合注射用抗肾病综合症出血热病毒单克症出血热病毒单克隆抗体（隆抗体（I型）型） 武汉生物制品所武汉生物制品所第四军医大学第四军医大学 鼠源鼠源临床研究临床研究治疗出血热治疗出血热抗人肝癌单抗抗人肝癌单抗 中科院细胞所中科院细胞所 鼠源鼠源临床研究临床研究抗乙型脑炎单

20、抗抗乙型脑炎单抗 北京生物制品所北京生物制品所第四军医大学第四军医大学 鼠源鼠源临床研究临床研究注射用重组人注射用重组人型型肿瘤坏死因子受体肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白抗体融合蛋白 上海美恩生物技术上海美恩生物技术有限公司有限公司嵌合嵌合临床研究临床研究第二节第二节 抗毒素与免疫血清抗毒素与免疫血清抗毒素与免疫血清抗毒素与免疫血清抗毒素（抗毒素（antitoxin）指用细菌外毒素或类毒素免疫）指用细菌外毒素或类毒素免疫动物取得的动物取得的免疫血清。免疫血清。外毒素外毒素指某些细胞生长繁殖过程中分泌到菌体外的一种代谢产物。其主要成指某些细胞生长繁殖过程中分泌到菌体外的一种代谢产物。其主要成分为

21、蛋白质。在人类疾病中，如产生于破伤风、白喉和肉毒中毒等。其毒性分为蛋白质。在人类疾病中，如产生于破伤风、白喉和肉毒中毒等。其毒性作用强，不同种细菌产生的外毒素对机体的毒性作用有明显不同，可选择性作用强，不同种细菌产生的外毒素对机体的毒性作用有明显不同，可选择性地作用于某些组织器官，引起特殊病变。外毒素不耐热、不稳定、抗原性强，地作用于某些组织器官，引起特殊病变。外毒素不耐热、不稳定、抗原性强，可刺激机体产生抗毒素，可中和外毒素，用作治疗。经甲醛处理可脱毒，做可刺激机体产生抗毒素，可中和外毒素，用作治疗。经甲醛处理可脱毒，做成类毒素，用作免疫预防剂。成类毒素，用作免疫预防剂。类毒素类毒素是细菌的

22、外毒素经甲醛处理后，失去毒性而仍保留其免疫原性，能刺是细菌的外毒素经甲醛处理后，失去毒性而仍保留其免疫原性，能刺激机体产生保护性免疫的制剂。激机体产生保护性免疫的制剂。目前我国生产的抗血清主要有：目前我国生产的抗血清主要有：白喉抗毒素白喉抗毒素、破伤风抗毒素破伤风抗毒素、气性坏疽抗毒素、肉、气性坏疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗蛇毒血清、毒抗毒素、抗蛇毒血清、抗狂犬病血清抗狂犬病血清。抗毒素的性质及作用机制抗毒素的性质及作用机制1）理化性质刺激机体产生针对各种决定簇的抗体是多克隆抗体2）抗毒活性临床上常用抗毒素（毒素的对应抗体）治疗外毒素所致疾病（白喉、破伤风）以及毒蛇咬伤。抗毒素血清是用类毒素、毒素

23、免疫马后，取其免疫血清制备的。马的免疫血清对患者具有二重性。一方面，它含有特异性抗体（抗毒素），可以中和相应的毒素，起到防治的作用；另一方面，马血清对人而言是异种蛋白，具有抗原性， 可引起血清病。抗毒素的制造抗毒素的制造1.免疫血清的制造 1）马匹选择 2）免疫原（精制类毒素或类毒素） 3）免疫方法（基础免疫和超免疫） 4）血清的分离2.抗毒素的精制 硫酸铵盐析法与胃酶消化联合抗毒素的应用抗毒素的应用白喉抗毒素白喉抗毒素破伤风抗毒素破伤风抗毒素肉毒抗毒素肉毒抗毒素抗蛇毒血清抗蛇毒血清第三节第三节 单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体的治疗机制1）中和作用2）示踪或导向作用3）竞争

24、性抑制作用/拮抗作用4）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用单抗的治疗应用单抗的治疗应用1）抗肿瘤2）抗器官移植排斥反应3）抗感染4）抗血栓形成5）解毒6）构建抗独特型抗体疫苗7）在自身免疫性疾病及变态反应性疾病中的应用8）毒品方面的应用9）血型鉴定单克隆抗体的诊断作用单克隆抗体的诊断作用1.T细胞及其亚群单抗诊断试剂2.病原体的单抗诊断试剂3.肿瘤单抗诊断试剂4.激素、酶等生物活性物质单抗诊断试剂5.生物制剂的单抗侦检试剂6.环境和食品卫生的单抗诊断试剂单克隆抗体的缺点单克隆抗体的缺点1.单克隆抗体具有免疫原性2.半衰期短3.靶吸收差4.生产复杂、价格昂贵第四节第四节 基因工程抗体基因工程抗体基因

25、工程抗体基因工程抗体将制备单克隆抗体的细胞工程技术与生产重将制备单克隆抗体的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术结组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术结合起来，对编码蛋白质的基因按不同需要进合起来，对编码蛋白质的基因按不同需要进行加工改造和重新组装，转染适当的受体细行加工改造和重新组装，转染适当的受体细胞后表达出抗体分子，这种经基因重组的抗胞后表达出抗体分子，这种经基因重组的抗体称为基因工程抗体，又称重组抗体。体称为基因工程抗体，又称重组抗体。基因抗体：通过基因工程手段，保留抗体重轻链可变区中主要基因抗体：通过基因工程手段，保留抗体重轻链可变区中主要与抗原结合的与抗原结合的

26、CDR功能区功能区, 而形成的各种功能抗体而形成的各种功能抗体Complementary-determining regions: CDR基因工程抗体的分类基因工程抗体的分类基因工程抗体的分类基因工程抗体的分类小分子抗体（1）Fab片段（2）单链抗体（single chain antibody，scFv）、双链抗体、三链抗体（3）微型抗体（minibody，两个scFv与抗体CH3区连接）（4）双特异性抗体（diabody）（5）其他形式抗体（细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体、最小结合单位等）抗体药物在应用中存在的问题：抗体药物在应用中存在的问题：一般必须用小鼠骨髓瘤制备单抗，故所得鼠源性单抗

27、，必须人源化，在临床上可减少异源性蛋白所引起的过敏反应和增加疗效。鼠源抗体人源化后，抗体效价明显降低，导致临床疗效降低。临床治疗需要大量的抗体(克级），故需要生物反应器制备抗体。由于抗体的产量和质量受到限制，而影响疗效。问题问题:工程细胞系工程细胞系,大规模生产工艺技术大规模生产工艺技术基因工程抗体的优点和缺点基因工程抗体的优点和缺点优点：不受动物品系（species)和抗体类型（isotype)的限制。利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，减少潜在的抗原表位，增强抗体的疗效。全人源化抗体，可以降低抗体的异源性和免疫源性，最大化提升抗体的的疗效。缺点：抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显降

28、低。目的： 减小鼠源性成份，降低HAMS反应（human against mouse syndrome)。 易于大规模生产和应用于临床。 保留抗体的抗原结合能力。基本原理： 借助基因工程手段，将编码Ab的重轻链可变区基因重组到真核表达载体上并进行表达。基因工程抗体的表达基因工程抗体的表达原核细胞和酵母可以用于表达小分子抗体和抗体片段大部分完整抗体和双链抗体、微型抗体等需要在CHO等哺乳动物细胞中表达利用完整的动植物体通过转基因的方法表达外源蛋白：如利用转基因烟草生产抗狂犬病毒抗体抗体工程的发展历程抗体工程的发展历程动物多克隆抗血清被抗生素所代替成份复杂，副反应严重鼠源单克隆抗体1975年，杂交

29、瘤技术制备单抗成功“魔弹”HAMA反应20世纪90年代初，抗内毒素单抗用于治疗脓毒败血症遭遇失败。抗体药物的研究进入低谷。分子生物学基因工程技术基因工程抗体基因工程抗体鼠源抗体的人源化及形式多样的改造抗体抗体工程就是指利用分子生物学、基因工程等手段对抗体进行各种不同的改造并在原核、真核细胞中表达制备的工程技术。马血清,破伤风,狂犬病1.人鼠嵌合抗体人鼠嵌合抗体（Chimeric Antibodies）原理：利用基因重组技术，把鼠抗体的重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定区的进行重组，减少鼠源结构，增加人源结构，而保持抗体与原抗原的特异性结合。缺点：鼠抗体部分亦能作为一种异种抗原，多次反复使用在人

30、体产生抗体及过敏反应（HAMS反应，human against mouse syndrome)。嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原降低，但亲和力明显下降。Chimeric antibodies杂交瘤细胞株获得两个可变区克隆载体(T载体)原核表达系统检测构建表达载体RT-PCR酶切测序酶切，连接转化是是否否酶切，连接1.获得鼠单抗重轻链可获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段。变区的基因片段。2. 基因片段插入含有人基因片段插入含有人IgG重轻链恒定区的表达重轻链恒定区的表达载体。载体。人鼠嵌合抗人鼠嵌合抗体的真核表体的真核表达在达在CHO细细胞胞（共转染模式（共转染模式和单载体转染模和单载体转染模

31、式）式） 3.这种嵌合抗体同鼠源抗体比较有以下两个优点：u 它可以按需要对抗体的效应基因进行选择或剪切。u 在治疗中使用人而不是鼠mAb的同种型，大大减小了鼠源mAb作为异种蛋白对人体的免疫原性，它通过避免抗同种型抗体的产生，减少了HAMA的生成。2.人源化抗体（人源化抗体（ humanized antibodies）Humanization or reshaping of murine antibodies is an attempt to transfer the full antigen specificity and binding avidity of murine monoclon

32、al antibodies to a human antibody by grafting the murine complementarity determining regions (CDRs) onto a human variable region framework。保留鼠CDR的人源化Ab65 to 90%可变区可变区人源化人源化CDRCDR移植移植AbAb制备原理制备原理 将鼠源mAb的6个互补决定区的氨基酸序列插入到人Ig的框架区，通常称为CDR移植。CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR，使人源抗体获

33、得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。抗原虽然主要和抗体的CDR接触，但FR区也常参作用，影响CDR的空间构型。因此换成人源FR区后，这种鼠源CDR和人源FR相嵌的V区，可能改变了单抗原有的CDR构型，结合抗原的能力会下降甚至明显下降。目前，对CDR移植的人源化路线是： 在鼠/人嵌合抗体的基础上，通过数据库检索、计算机分子模拟等寻找出有最大同源性的人可变区模板，综合考虑表面残基、与CDR有相互作用或对空间结构有重要影响的残基，确定需要保留和改变的关键残基，再通过模拟基因合成，表达检测实际效果，进行必要的修正，来获得高亲和力的治疗mAb。MouseHumanHumanisedhyperv

34、ariableframeworkhumanization-CDR grafting CDR residues from variable region of a mouse mAb are transferred to human antibody frameworks that have high sequence homology with the mouse counterpartsAllows specificityAllows effector functionsLess immunogenic3. 全人抗体（全人抗体（Fully human mAbs）transgenic mice

35、 Human antibody-display librariesTo make Human mAb from human being全人抗体全人抗体100%1） Transgenic mice1.首先把小鼠编码Ig重轻链的基因剔除。2.制备表达人的Ig重轻链的转基因小鼠。3.上二种小鼠回交，获得只表达人Ig重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体。Creation of Fully Human mAbs From Transgenic MiceReplace murine immunoglobulin (Ig)G genes with human IgG genesWein

36、er LM. J Immunother. 2006;29:1-9.Yang X-D, et al. Crit Rev Oncol Hematol. 2001;38:17-23.Mouse strain incapable ofproducing mouse antibodiesHuman Ig lociBreedingBreedingMouse embryonic stem cells containing human antibody genesMouse strain producinghuman and mouse antibodiesMouse embryonic stem cells

37、 with inactivated mouse heavy and light chain lociMouse Ig lociMouse strain producingonly human antibodiesTransgenic mouse-advantageHave a repertoire of fully human IgG1 gave researchers an alternative route to human mAbs through active immunization, without the protocol restrictions associated with

38、 human studies. Transgenic mouse-drawbacksAs the immune response in transgenic mice is sometimes less robust than in strains that are used to generate mouse mAbs, more immunizations or antibody screens are often required.These transgenic mice cannot exactly reproduce the human antibody response beca

39、use of repertoire differences and because the genetic background ofthe murine host affects antigen processing, B-cell ontology and regulation (e.g.,tolerance mechanisms). At present, these transgenic mice are protected intellectual property and therefore not commonly available2）噬菌体抗体库技术）噬菌体抗体库技术(Pha

40、ge antibody library technique)把人的Ig重轻链可变区基因片段展示在l噬菌体表面,组成抗体库。通过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联，易进行分子克隆和基因操作。抗体库的来源影响筛选结果（免疫和正常人）。高通量筛选与抗原结合的抗体，但亲和力低。scFv-single-chain variable fragmentsDisplay technologies-strategyPhage Display Library-Antibody library-from Immunology Today (2000), 21, 371-378 Start from human gen

41、esNew specificities?Less immunogenic? Can screen a larger repertoireLoss of combinatorial specificities Bypass immunisation naive libraryLow affinity Affinity maturation in vitroExtra steps, more immunogenic? Economical production in bacteria Only fragmentsPhage Display - advantagesPhage Display - d

42、rawbackUnnatural pairings of the antibody heavy and light chain componentsThe method of presentation of antigen as bait for panning may affect the number and distribution of available neutralizing epitopes.3）用人的骨髓瘤细胞直接制备）用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体全人抗体关键点：建立好的人骨髓瘤细胞。稳定性高和融合率高。(Human antibodies 2002, 11:85-96)M

43、ousemyelomaHumanmyelomaDouble selecting markers G418 and HATHuman LN B cells4）. B细胞永生化技术：用细胞永生化技术：用EB病毒将人淋巴细胞永生化病毒将人淋巴细胞永生化可产生分泌抗体的可产生分泌抗体的B细胞克隆。这一技术较为成熟，但细胞克隆。这一技术较为成熟，但是存在抗体分泌不稳定的缺点，限制了其应用。或直接是存在抗体分泌不稳定的缺点，限制了其应用。或直接分离分泌抗体的分离分泌抗体的B细胞细胞,用用PCR获得重轻连获得重轻连,构建全人抗体构建全人抗体.）Single B cell RT-PCR Nature Biot

44、echnology,2008,26:886-887.the strategy of single cell RT-PCRThe time frame-one month各种全人抗体生产技术比较优点缺点微生物表面展微生物表面展示技术示技术很成熟，体外进行抗体亲和力的完很成熟，体外进行抗体亲和力的完善，善，抗体的重轻链不是天然配对，抗体的重轻链不是天然配对，没有在体外还原天然抗体的构没有在体外还原天然抗体的构象象转基因小鼠转基因小鼠可以产生全人免疫球蛋白库，不受可以产生全人免疫球蛋白库，不受到人体试验的限制到人体试验的限制转基因老鼠还是并不能生产精转基因老鼠还是并不能生产精确的全人抗体确的全人抗体

45、EBVEBV病毒转化病毒转化EBVEBV病毒转化产生的病毒转化产生的B B细胞杂交瘤用细胞杂交瘤用于产生中和抗体，材料来源广泛于产生中和抗体，材料来源广泛B B细胞杂交瘤存在染色体不稳定细胞杂交瘤存在染色体不稳定，易丢失的缺陷，易丢失的缺陷单个单个B B细胞细胞RT-PCRRT-PCR1.1.方便方便，常规分子克隆实验条件，常规分子克隆实验条件2.2.快速快速，条件优化后仅需要，条件优化后仅需要3030天天3.3.高通量，高通量，针对抗原特异针对抗原特异抗体库抗体库4.4.亲和力和特异性亲和力和特异性：亲和力：亲和力很高很高，获得针对获得针对抗原各表位抗原各表位的抗体的抗体5.5.适用通过疫苗

46、治疗的各种疾病适用通过疫苗治疗的各种疾病慢期炎症或致死性病原体如慢期炎症或致死性病原体如HIVHIV，癌症和自身免疫病方面应用，癌症和自身免疫病方面应用受到限制受到限制Source of antibodies on the market(according to a “market analyst”)SourceAntigenicity% HumanMouse+0 %Chimeric+60-70%Humanised- 90%Human-100%三、抗体靶向治疗的新思考三、抗体靶向治疗的新思考问题1：在临床上抗体用量大（几百毫克到克级）， 价格昂贵。在不发达国家难于承受。问题2：由于专利限制，中

47、国难于进行me too药仿制。解决方案：能否利用中和性抗体的靶向作用，确定能否利用中和性抗体的靶向作用，确定 抗体作用的靶点位子，用小分子替代，抗体作用的靶点位子，用小分子替代， 设计新药？设计新药？四、工程抗体的未来发展与展望四、工程抗体的未来发展与展望1. 单克隆抗体的市场需求单克隆抗体的市场需求 对20042011年全球治疗单抗市场的分析2. 抗体药物的应用领域抗体药物的应用领域抗器官移植排斥反应；肿瘤导向治疗； 哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病； 心脑血管疾病；感染性疾病；其他小分子抗体小分子抗体分子量小，穿透性强，抗原性弱，表

48、达容易，易于进行基因工程改造，可用于医学影像学分析需提高其小分子抗体的稳定性，使重轻链分子在表达后能进行充分的折叠；提高与抗原的结合能力以及表达系统的优化 胞内抗体、催化抗体：胞内抗体是指在细胞内表达，可以特异性结合细胞内蛋白靶点，从而起到调控细胞内信号转导途径，调节细胞代谢过程的小分子抗体。催化抗体又称抗体酶，是指具有蛋白酶催化活性的抗体。该技术在有机化学领域具有很好的应用前景。抗体药物抗体药物“生物导弹”特异性好，疗效显著，靶点明确，机理清楚抗体治疗作用的发挥主要依靠（1）抗体与靶抗原的特异性结合（2）利用抗体的识别特异性，发挥导向作用，将效应分子“运输”至特定区域发挥作用。 效应分子主要

49、包括三类，即放射性核素（如I131）、化学药物（如氨甲喋呤）和植物、细菌毒素（如阿霉素、长春碱类衍生物）。另外，也有连接细胞因子、肽类分子的抗体治疗剂。抗体药发挥治疗作用的三种机制抗体药发挥治疗作用的三种机制Pharmacokinetics of intact antibodies versus fragments基因工程抗体与基因工程抗体与噬菌体噬菌体展示技术展示技术一、噬菌体展示技术的原理一、噬菌体展示技术的原理LeadHvLinkLvEPIII融合蛋白PIII基因型表达型噬菌体抗体库的分类噬菌体抗体库的分类噬菌体抗体是在噬菌体表面表达的抗体分子Fab或scFv, 这种表达是通过Fab段或

50、scFv与噬菌体外壳蛋白pIII或pVIII蛋白形成融合蛋白而完成其特点是它既可以识别相应抗原与之相结合, 其相应载体即噬菌体又能够感染宿主菌进行再扩增, 将细胞全套可变区基因克隆出来, 组成噬菌体抗体的群体, 即噬菌体抗体库。这种建立噬菌体抗体库的全套方法即称为噬菌体抗体库技根据抗体基因的来源和组成不同，噬菌体抗体库可分为天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。抗原抗原噬菌体抗体库噬菌体抗体库结合与洗涤结合与洗涤洗脱洗脱扩增扩增再循环再循环Amplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea) ELISAb) Specificityc) Seq

51、uencingd) Affinitye) ActivityE.coli感染和扩增基因工程抗体表达体系基因工程抗体表达体系小分子抗体小分子抗体小分子抗体的优点： 1. 制备方法较其他基因工程抗体简单。 2.免疫原性要比原来的McAb弱得多。如果将改形抗体构建成小分子抗体，更有可能消除其免疫原性。 3. 由于分子量小，小分子抗体更容易通过血管壁，穿透实体瘤，有利于肿瘤的治疗。 4. 由于没有Fc段，不能与非靶细胞的Fc受体结合，更能集中到达肿瘤部位，同时由于没有Fc调节IgG的分解代谢，在体内半寿期短 ，周转快，有利于放射免疫成像检查肿瘤。 小分子抗体的优点：小分子抗体的优点： 5. 分子小，能与分布于病毒表面凹槽的抗原结合，有利于病毒性疾病的治疗。 6. 在小分子抗体基因的3