微生物学实验-1 口腔微生物的染色观察与显微镜油镜的使用;细菌的革兰氏染色

1、微微 生生 物物 学学 实实 验验微生物学实验应当掌握微生物学实验应当掌握1、微生物的、微生物的观察观察方法（制片、染色、油方法（制片、染色、油镜的使用）镜的使用）2、微生物的、微生物的培养培养方法（培养基配制、分方法（培养基配制、分装、包扎、灭菌）装、包扎、灭菌）3、无菌操作技术无菌操作技术（火焰灭菌、倒平板、（火焰灭菌、倒平板、划线、涂平板、接种）划线、涂平板、接种）本课程的成绩考核：本课程的成绩考核：基础实验：基础实验：60% 由由单个实验的成绩相加单个实验的成绩相加组成。每次实验由实组成。每次实验由实验指导老师根据出勤、实验操作、实验报告等验指导老师根据出勤、实验操作、实验报告等进行评

2、定，具体比例为：进行评定，具体比例为：实验出勤及实验态度实验出勤及实验态度占占20；实际操作；实际操作30；实技能考核；实技能考核30；实；实验报告占验报告占20。自主设计实验：自主设计实验：40% 设计实验方案设计实验方案 实验操作实验操作 总结总结实验一实验一 细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色 实验目的实验目的 实验原理实验原理 实验材料实验材料 实验方法实验方法实验结果实验结果 注意事项注意事项 实验报告实验报告 思考题思考题微生物学实验微生物学实验-11. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。分类鉴定中的重要性。2. 学习并掌握革兰氏染色

3、技术，进一步学习并掌握革兰氏染色技术，进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。熟练光学显微镜油镜的使用技术。 实验目的实验目的 革兰氏染色法（革兰氏染色法（Gram staining）是微生物学中常用的一种染是微生物学中常用的一种染色方法，该染色法由丹麦医色方法，该染色法由丹麦医生（生（Christian Gram）于）于1884年创立，故名。年创立，故名。 实验原理实验原理 G G+ +细菌细菌G G- -细菌细菌革兰氏染色机理革兰氏染色机理 G+细菌由于细菌由于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧密度较紧密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而，

4、故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔会因脱水而明显收缩，因不含脂类，故明显收缩，因不含脂类，故乙醇处理不能在壁上溶出缝乙醇处理不能在壁上溶出缝隙隙，因此，因此，结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其细胞内，使其使其呈现紫色呈现紫色。 G-细菌因其细菌因其壁薄、肽聚糖含量低和交联松散壁薄、肽聚糖含量低和交联松散，故遇乙醇后，故遇乙醇后，肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当肽聚糖网孔不易收缩，加上它的类脂含量高，所以当乙乙醇把类脂溶解后醇把类脂溶解后，在，在细胞壁上就会出现较大的缝隙细胞壁上就会出现较大的缝隙，结，结晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇晶紫

5、与碘的复合物极易被溶出细胞壁，因此，通过乙醇脱色后，细胞又脱色后，细胞又呈无色呈无色。这时再经番红复染，就使。这时再经番红复染，就使G-细细菌染成菌染成红色红色，而，而G+细菌仍呈紫色。细菌仍呈紫色。结晶紫初染结晶紫初染全部细胞紫色全部细胞紫色碘液媒染碘液媒染全部细胞紫色全部细胞紫色乙醇脱色乙醇脱色G G- - 菌无色菌无色G G+ + 菌紫色菌紫色 番红复染番红复染 G G- - 菌红色菌红色 G G+ + 菌紫色菌紫色革兰氏染色各步骤时细菌的外观革兰氏染色各步骤时细菌的外观结晶紫初染结晶紫初染 碘液媒染碘液媒染 乙醇脱色乙醇脱色 番红复染番红复染结晶紫结晶紫碘液碘液乙醇乙醇番红番红菌种菌种

6、 大肠杆菌大肠杆菌 （Escherichia coli） 金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）试剂：试剂： 蒸馏水；蒸馏水； 草酸铵结晶紫染液草酸铵结晶紫染液 ；卢戈氏碘液；卢戈氏碘液 95%乙醇；乙醇； 番红复染液；香柏油；二甲苯番红复染液；香柏油；二甲苯光学显微镜光学显微镜 实验材料实验材料 革兰氏染色操作步骤革兰氏染色操作步骤水洗水洗干燥干燥 镜检镜检（油镜）（油镜）涂片涂片滴水滴水取菌取菌火焰固定火焰固定结晶紫染色结晶紫染色1分钟分钟水洗水洗碘液碘液1分钟分钟 乙醇脱色乙醇脱色（2030秒）秒）水洗水洗番红番红1分钟分钟水洗水洗 实验方法实验方法

7、自然干燥自然干燥E.coliS. aureus混合菌混合菌涂片方法示意图涂片方法示意图分辨率分辨率 D= 数值孔径数值孔径 NAnsinan=1.515空气空气n=12NA2a电源电源电源电源显微镜油镜的使用与保护显微镜油镜的使用与保护1.插上电源插头，打开显微镜电源开关。插上电源插头，打开显微镜电源开关。2.调节显微镜光源。调节显微镜光源。3.先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约先用低倍镜、高倍镜查找标本视野，下降载物台约2cm ，加加香柏油香柏油一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。一滴于标本的待检部位，换用油镜观察。4.换用油镜后，眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至换用油镜后，

8、眼睛从侧面注视油镜头，缓慢上升载物台至油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压油圈不再扩大为止，此时镜头几乎与装片接触，但不可压及装片。及装片。5.观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。观察标本时，双眼同时挣开，左眼观察，右眼画图。6.油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用油镜用毕，转动粗调将载物台下降，取下标本，用擦镜纸擦镜纸沾少许沾少许二甲苯二甲苯将镜头擦净，然后再用将镜头擦净，然后再用擦镜纸擦镜纸擦去擦去二甲苯二甲苯。7. 使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗，使各部分还原，物镜镜头呈八字形，光源强度调至最暗，关闭电源，罩上防尘罩，收拾干净台面。关闭电

9、源，罩上防尘罩，收拾干净台面。 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(G+)大肠杆菌大肠杆菌(G-) 实验结果实验结果大肠杆菌大肠杆菌(G-) 和金黄色葡萄球菌和金黄色葡萄球菌(G+) 注意事项注意事项1. 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；自然干燥自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。2.染色过程中勿使染色液干涸。染色过程中勿使染色液干涸。3.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足阴性乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，会使阳性菌被误染成阴菌被误染成阳性菌；脱色过

10、度，会使阳性菌被误染成阴性菌。性菌。4. 选用培养选用培养1824h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使会使革兰氏阳性菌转成阴性反应。体死亡或自溶常使会使革兰氏阳性菌转成阴性反应。 实验报告实验报告Escherichia coli 10100Staphylococcus aureus 10100混合菌混合菌 101001通过本实验你认为哪些环节会影响革兰氏通过本实验你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？么？ 思考题思考题实验二实验二 口腔微生物的染色观察与口腔微生物的染色观察与显

11、微镜油镜的使用显微镜油镜的使用 实验目的实验目的 实验原理实验原理 实验材料实验材料 实验方法实验方法实验结果实验结果 注意事项注意事项 实验报告实验报告 思考题思考题微生物学实验微生物学实验-1学习并初步掌握细菌的单染色法。学习并初步掌握细菌的单染色法。了解口腔内微生物的种类。了解口腔内微生物的种类。掌握油镜的使用方法。掌握油镜的使用方法。 实验目的实验目的 细菌的单染色法是微生物学中常用的一种染细菌的单染色法是微生物学中常用的一种染色方法。色方法。 人体口腔中人体口腔中特别是在牙垢中，特别是在牙垢中，有有细菌、真菌、细菌、真菌、支原体、口腔原虫、病毒等数量众多的微生物，支原体、口腔原虫、病

12、毒等数量众多的微生物，用无菌牙签刮取少许牙垢，涂片染色后用显微用无菌牙签刮取少许牙垢，涂片染色后用显微镜下即可观察到各类微生物的形态。镜下即可观察到各类微生物的形态。 实验原理实验原理 试剂：试剂： 蒸馏水；蒸馏水； 石碳酸复红染液；香柏油；石碳酸复红染液；香柏油； 二甲苯二甲苯光学显微镜、灭菌牙签、载玻片光学显微镜、灭菌牙签、载玻片 实验材料实验材料口腔微生物染色操作步骤口腔微生物染色操作步骤干燥干燥镜检（油镜）镜检（油镜）涂片涂片滴水滴水刮取牙垢刮取牙垢火焰固定火焰固定革兰氏染色或革兰氏染色或 复红染色复红染色1 1分钟分钟水洗水洗 实验方法实验方法自然干燥自然干燥 实验结果实验结果 注意事项注意事项1. 载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。 2. 取样时只需轻刮牙齿表面，肉眼可见少许牙垢取样时只需轻刮牙齿表面，肉眼可见少许牙垢即可，滴水不宜过多，以免干燥时间过长；涂即可，滴水不宜过多，以免干燥时间过长；涂片不宜过厚，以免水洗不完全造成背景杂乱。片不宜过厚，以免水洗不完全造成背景杂乱。3. 自然干燥自然干燥后再进行火焰固定（以玻片不烫手为后再进行火焰固定（以玻片不烫手为宜）。宜）。4. 染色过