蛋白表达纯化 ppt课件

1、北京康为世纪生物科技北京康为世纪生物科技 Beijing CoWin Biotech Co.,Ltd.康为世纪 原核表达及纯化蛋白表达流程 序列分析序列分析 表构建达载体表构建达载体 蛋白表达蛋白表达 蛋白纯化蛋白纯化 蛋白检测蛋白检测原核表达非交融型表达载体非交融型表达载体交融型表达载体交融型表达载体- - 带标签的表达载体带标签的表达载体His His 、GSTGST具有编码不同多肽的标签序列，为定位、检测或纯化目的蛋白提供方具有编码不同多肽的标签序列，为定位、检测或纯化目的蛋白提供方便。便。假设蛋白较小可参与交融标签，促进蛋白正确折叠。假设蛋白较小可参与交融标签，促进蛋白正确折叠。- -

2、 分泌型表达载体分泌型表达载体可使外源基因产物直接分泌到大肠杆菌的外周腔，减少在胞内表达且可使外源基因产物直接分泌到大肠杆菌的外周腔，减少在胞内表达且表达产物表达产物对细菌的毒性，同时外周腔中的蛋白酶活性低，有助于提高交融蛋白对细菌的毒性，同时外周腔中的蛋白酶活性低，有助于提高交融蛋白的稳定性。的稳定性。 原核生物表达系统优势：遗传背景清楚、表达量高、产物易纯化、运用范围广。优势：原核表达系统翻译后修饰体系不完善，表达产物活性低。原核表达原核表达 目的基因的获取 选择载体、构建重组表达质粒 转化受体菌 重组体的挑选鉴定I 重组表达载体克隆重组表达载体克隆1. 目的基因获取： 基因组DNA、mR

3、NA反转录cDNA、人工合成2. 常用载体 ： His标签： pET系列pET28a、pET32a、pQE系列 GST标签：pGEX系列3. 构建重组质粒： 选择适宜的内切酶位点、酶切、衔接4. 转化感受态细胞： 热击法转化非表达型感受态菌5. 重组体的鉴定： 阳性抗药克隆菌落PCR 阳性抗药克隆提质粒、酶切鉴定 测序原核表达原核表达转化表达菌株转化表达菌株优化诱导条件优化诱导条件表达蛋白检测表达蛋白检测放大培育放大培育I I 蛋白诱导表达蛋白诱导表达1. 表达菌株选择：pET系统常规表达菌株：BL21 表达毒性蛋白：BL21pLys适宜表达真核基因：RossetaBL21衍生菌，补充大肠杆菌

4、短少的6种稀有密码子2. 诱导表达pET系统采用T7启动子，诱导剂：IPTG 诱导要素：IPTG浓度、诱导温度、诱导时间设置阴性对照：未加IPTG诱导3. SDS-PAGE、WB检测，确定目的蛋白 未诱导、诱导后的全菌、诱导后上清、诱导后沉淀包涵体表达及添加蛋白可溶性优化诱导条件，添加蛋白溶解性优化诱导条件，添加蛋白溶解性 在在 E.coli中表达的重组蛋白经常以不溶的、无活性蛋白聚集体的方式中表达的重组蛋白经常以不溶的、无活性蛋白聚集体的方式表达，被称作包涵体。即使在构成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶表达，被称作包涵体。即使在构成包涵体时，还是有一部分目的蛋白是溶解的。由于解的。由于pE

5、T 系统的高表达程度，即使有大量的目的蛋白聚集构成包涵系统的高表达程度，即使有大量的目的蛋白聚集构成包涵体，也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成体，也会有相当多的可溶性目的蛋白存在。在通常情况下，降低蛋白合成速率，如降低诱导培育温度及在根本培育基中生长都会使目的蛋白的可溶速率，如降低诱导培育温度及在根本培育基中生长都会使目的蛋白的可溶性添加。性添加。 诱导和培育条件：诱导和培育条件：37包涵体，包涵体， 30，低温，低温(15-20)诱导过夜，诱导过夜， IPTG浓度，诱导后的培育条件浓度，诱导后的培育条件细胞周质定位：选择带有信号肽的载体细胞周质定位：选择带有信号肽的

6、载体pET12/20/22 宿主菌：尝试可表达真核蛋白的宿主菌：尝试可表达真核蛋白的Rosseta菌株菌株 裂解缓冲液：普通的裂解缓冲液：普通的Binding buffer中一些疏水或膜构造蛋白会是不溶中一些疏水或膜构造蛋白会是不溶的，但假设参与非离子去污剂就会变成可溶。的，但假设参与非离子去污剂就会变成可溶。 表达载体选择标签选择：标签选择： 6XHis：- 适宜任何表达系统适宜任何表达系统- 纯化后不需切割标签纯化后不需切割标签- 纯化简单，也可纯化包涵体蛋白纯化简单，也可纯化包涵体蛋白- 小标签对重组蛋白折叠影响小小标签对重组蛋白折叠影响小 GST：谷胱甘肽巯基转移酶- 适宜任何表达系统

7、- 相对可添加蛋白的可溶性 - 纯化后需切除标签 - 标签蛋白能够会构成二聚体标签蛋白标签蛋白 ： 优点优点 - 可以提高蛋白的可溶性和稳定性。可以提高蛋白的可溶性和稳定性。 - 用亲和层析的方法对蛋白进展纯化，用亲和层析的方法对蛋白进展纯化， 采用通用的检测标签的方法。采用通用的检测标签的方法。 缺陷缺陷 - 标签能够对蛋白的构造、折叠和生标签能够对蛋白的构造、折叠和生物学活性有影响。物学活性有影响。- 切除标签时，酶切效率不会到达切除标签时，酶切效率不会到达100%，会有氨基酸剩余。，会有氨基酸剩余。His标签：标签： pET系列系列常规表达载体：常规表达载体：pET28a、pET32a、

8、pQE系列系列周质腔表达载体：周质腔表达载体： CBD交融交融(pET36/37)、Dsb交融交融(pET39/40) 采用带采用带pelB/ompT引导肽的载体引导肽的载体(pET12/20/22) 采用带采用带MBD交融交融(pMAL载体载体, Biolabs) 、SUMO交融交融GST标签：标签：pGEX系列系列pET-28a蛋白纯化 蛋白纯化 方法 - 亲和层析 - 凝胶过滤 - 离子交换层析 亲和层析经过生物分子之间特异性的相互作用来分别物质的方法。 配体受体 抗原抗体 底物酶常用的亲和配基配基目标蛋白洗脱条件其他Ni2+组氨酸标签(His) 咪唑载体：pET谷胱甘肽谷胱甘肽巯基转移

9、酶(GST)还原型谷胱甘肽载体: pGEX直链淀粉麦芽糖结合蛋白（MBP）麦芽糖载体：pMAL，具有MBP信号序列进行分泌表达，改善溶解性proteinA/G不同哺乳动物的IgG Fc 段低ph值，甘氨酸从血清或者腹水中纯化总IgG蛋白纯化蛋白纯化主要步骤主要步骤样品预备样品预备缓冲液预备缓冲液预备- 结合缓冲液结合缓冲液- 洗脱缓冲液洗脱缓冲液组装层析柱组装层析柱纯化纯化检测定量检测定量CW0009 蛋白纯化产品蛋白纯化产品Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒标签蛋白纯化试剂盒产品特点：产品特点： 4个镍离子结合位点，结合更结实个镍离子结合位点，结合更结实 载量高，运用方便载量高，

10、运用方便 配置从抽提开场至纯化的全套试剂配置从抽提开场至纯化的全套试剂 适用于纯化可溶性蛋白及包涵体蛋白适用于纯化可溶性蛋白及包涵体蛋白问题问题解决办法解决办法填料保存2-8、20%乙醇浸没。明星纯化产品明星纯化产品2ml/￥398 5ml/ ￥598 6 ml 10 ml样品处置：样品处置：搜集菌体后，每搜集菌体后，每100 mg菌体湿重参与菌体湿重参与1-5 ml细菌裂解液，超声裂解菌体。离心，取细菌裂解液，超声裂解菌体。离心，取上清。上清。缓冲液配制：缓冲液配制：请运用高纯度的试剂配制缓冲液，并经过请运用高纯度的试剂配制缓冲液，并经过0.45 m过滤器过滤。为防止柱子被堵塞，建议过滤器过

11、滤。为防止柱子被堵塞，建议将裂解液进展离心，或者运用将裂解液进展离心，或者运用0.45 m过滤器过滤。过滤器过滤。组装层析柱：组装层析柱：将填料混匀后参与层析柱，室温静止将填料混匀后参与层析柱，室温静止10分钟，待凝胶与溶液分层后，让乙醇经过重力作用分钟，待凝胶与溶液分层后，让乙醇经过重力作用缓慢流出。缓慢流出。向装填好的柱中参与向装填好的柱中参与5倍柱床体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用倍柱床体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用8倍柱体积的倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡终了后即可上样。平衡柱子，平衡终了后即可上样。成分Tris-HCl（PH 7.9）咪唑NaClSol

12、uble Binding Buffer20 mM10 mM0.5 MSoluble Elution Buffer20 mM500 mM0.5 MHis标签蛋白纯化标签蛋白纯化纯化介质：纯化介质：Ni-琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶CWBIO 填料具有填料具有4个个Ni2+ 螯合位点螯合位点载载 量：量： 20-30mg His标签蛋白标签蛋白/ml填料填料CWBIO粒粒 径：径： 50-160mCWBIO纯化：纯化：将菌体裂解液负载上柱，流速为将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积倍柱体积/小时。小时。运用运用15倍柱体积的倍柱体积的Soluble Binding Buffer冲洗柱子，搜集流穿峰。冲

13、洗柱子，搜集流穿峰。运用运用5倍柱体积的倍柱体积的Soluble Elution Buffer洗脱，搜集洗脱峰。洗脱，搜集洗脱峰。洗脱后，依次运用洗脱后，依次运用3倍柱体积的倍柱体积的Soluble Binding Buffer和和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用，再用3倍柱体积的倍柱体积的20%乙醇平衡乙醇要将填料浸没，乙醇平衡乙醇要将填料浸没，4保管。保管。检测分析：检测分析： 凝胶填料Protein A 琼脂糖凝胶运用：运用： 纯化抗血清或腹水中的总纯化抗血清或腹水中的总IgG，尤其对人，尤其对人IgG1、IgG2、IgG4、小鼠、小鼠IgG2a、IgG2b具

14、有高亲和具有高亲和力。力。Protein G 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶运用：运用： 纯化抗血清或腹水中的总纯化抗血清或腹水中的总IgG,对人对人 IgG3, 小鼠小鼠 IgG1, 大鼠大鼠 IgG2a等具有高亲和力等具有高亲和力Ni 琼脂糖凝胶GST 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶运用：运用： 纯化带纯化带His标签蛋白。标签蛋白。运用：运用： 纯化带纯化带GST标签蛋白。标签蛋白。蛋白纯化常见问题 没有出现纯化蛋白没有出现纯化蛋白 纯化前将目的蛋白的表达量进展优化，确保表达量最纯化前将目的蛋白的表达量进展优化，确保表达量最大大 保证蛋白在纯化过程中不降解，纯化条件低温、纯化保证蛋白在纯化过程中不降解，纯化条件低温、纯化速度快速度快 标签蛋白没有暴露。应在变性条件下进展纯化标签蛋白没有暴露。应在变性条件下进展纯化 没有洗脱下来没