植物基因工程

1、会计学1植物基因工程植物基因工程（1 1）从种类繁多的植物基因群体中分离出有用的基因。）从种类繁多的植物基因群体中分离出有用的基因。（2 2）寻找或者构建植物克隆载体，使其与人们感兴趣的外源基因重组并能被导入）寻找或者构建植物克隆载体，使其与人们感兴趣的外源基因重组并能被导入到到植物细胞中去。植物细胞中去。（3 3）将重组的载体通过各种途径导入植物受体细胞中去，并整合到植物寄主染色体）将重组的载体通过各种途径导入植物受体细胞中去，并整合到植物寄主染色体的基因组上。的基因组上。（4 4）使获得带有目的基因的植物细胞或者组织再生成形态上正常的健康的植株。这）使获得带有目的基因的植物细胞或者组织再生

2、成形态上正常的健康的植株。这种植株称为转基因植物。种植株称为转基因植物。 （5 5）在理想的情况下，使这些转基因植物通过有性过程，将外源目的基因持续地传）在理想的情况下，使这些转基因植物通过有性过程，将外源目的基因持续地传种接代下去。种接代下去。一、植物基因工程的主要内容和研究方向一、植物基因工程的主要内容和研究方向根据目前的植物基因工程研究状况，大致可把植物基因工程的研究方向亦即研究目根据目前的植物基因工程研究状况，大致可把植物基因工程的研究方向亦即研究目的主要分为以下几类：的主要分为以下几类： 提高光合作用效率。提高光合作用效率。让重要的经济作物转变为固氮植物。让重要的经济作物转变为固氮植

3、物。增加种子的营养价值。增加种子的营养价值。提高农作物抗病虫害及除草剂的能力。提高农作物抗病虫害及除草剂的能力。增加植物次生代谢产物的产率。增加植物次生代谢产物的产率。二、植物基因工程的受体细胞二、植物基因工程的受体细胞从植物基因工程的表达角度考虑，植物基因工程可以说是由两大部分组成：从植物基因工程的表达角度考虑，植物基因工程可以说是由两大部分组成：受体系统；受体系统；载体系统。载体系统。目前植物基因工程所用的受体系统大致可分为三类：目前植物基因工程所用的受体系统大致可分为三类：植物细胞植物细胞原生质体原生质体植物组织。植物组织。三、植物基因工程的载体系统三、植物基因工程的载体系统作为载体使用

4、的必须是能进入植物寄主细胞内进行复制和表达的核酸分子。作为载体使用的必须是能进入植物寄主细胞内进行复制和表达的核酸分子。目前发展起来的植物基因转移的载体系统分为两大类：目前发展起来的植物基因转移的载体系统分为两大类：一是病毒载体系统；一是病毒载体系统；二是质粒载体系统。二是质粒载体系统。1 1植物基因转移的病毒载体植物基因转移的病毒载体 植物病毒跟其它病毒一样，离开植物细胞后表现出休眠状态。一旦感染植物并植物病毒跟其它病毒一样，离开植物细胞后表现出休眠状态。一旦感染植物并进入植物细胞，立即就依靠寄主进行基因的复制和表达，合成出成熟的病毒。植物进入植物细胞，立即就依靠寄主进行基因的复制和表达，合

5、成出成熟的病毒。植物病毒感染效率高，将其作为载体既可以获得较高的基因转化效率，又可以使感染的病毒感染效率高，将其作为载体既可以获得较高的基因转化效率，又可以使感染的外源基因随着病毒基因组的复制而扩增，因此植物病毒可以被发展成为很有价值的外源基因随着病毒基因组的复制而扩增，因此植物病毒可以被发展成为很有价值的克隆载体。克隆载体。目前正在研究并发展作为植物基因克隆载体的病毒有三种不同的类型，即单链目前正在研究并发展作为植物基因克隆载体的病毒有三种不同的类型，即单链RNARNA植植物病毒、单链物病毒、单链DNADNA植物病毒和双链植物病毒和双链DNADNA植物病毒。植物病毒。目前已经建立的目前已经建

6、立的CaMV DNACaMV DNA克隆载体主要有三类：克隆载体主要有三类：（1 1）由有缺陷的）由有缺陷的CaMV DNACaMV DNA病毒分子与另一个辅助性的病毒分子组成一个互补的载体系病毒分子与另一个辅助性的病毒分子组成一个互补的载体系统。辅助性的病毒分子给缺陷性的统。辅助性的病毒分子给缺陷性的CaMV DNACaMV DNA病毒分子提供所缺乏的功能。这两种分子病毒分子提供所缺乏的功能。这两种分子单独都不表现出活性。单独都不表现出活性。（2 2）将）将CaMV DNACaMV DNA整合到整合到TiTi质粒质粒DNADNA分子上，组成重组的载体。分子上，组成重组的载体。（3 3）构成带

7、有）构成带有CaMV 35SCaMV 35S启动子的融合基因，在植物细胞中表达外源基因。启动子的融合基因，在植物细胞中表达外源基因。CaMV 35SCaMV 35S启启动子是一种强启动子。目前已经有许多分子生物学家都热衷于使用动子是一种强启动子。目前已经有许多分子生物学家都热衷于使用CaMV 35SCaMV 35S启动子在启动子在植物细胞中表达外源目的基因。植物细胞中表达外源目的基因。2 2植物基因转移的质粒载体植物基因转移的质粒载体 植物基因转移所用的质粒载体是在两种特殊的植物细菌质粒的基础上发展起来植物基因转移所用的质粒载体是在两种特殊的植物细菌质粒的基础上发展起来的。这两种质粒是的。这两

8、种质粒是TiTi质粒和质粒和RiRi质粒。质粒。TiTi质粒在根癌农杆菌内，质粒在根癌农杆菌内，RiRi质粒在发根农杆菌质粒在发根农杆菌内。内。 发根农杆菌是另一种植物细菌，它可以在植物感染部位诱导另一种肿瘤的发生发根农杆菌是另一种植物细菌，它可以在植物感染部位诱导另一种肿瘤的发生，使植物的感染部位产生许多根状的结构，就象长出了许多根，故叫做发状根。发，使植物的感染部位产生许多根状的结构，就象长出了许多根，故叫做发状根。发根农杆菌内也含有一种大质粒，被命名为根诱导质粒，简称为根农杆菌内也含有一种大质粒，被命名为根诱导质粒，简称为RiRi质粒。发状根的形质粒。发状根的形成就是由成就是由RiRi质

9、粒引起的。质粒引起的。Ti Ti 质粒质粒TiTi质粒和质粒和RiRi质粒在结构上和功能上有许多相似的地方。质粒在结构上和功能上有许多相似的地方。TiTi质粒和质粒和RiRi质粒均属质粒均属于大质粒，大小约为于大质粒，大小约为200200800kb800kb。两者都含有能够控制肿瘤发生的两种基因片段。两者都含有能够控制肿瘤发生的两种基因片段。这两个基因区域分别是这两个基因区域分别是T-DNAT-DNA区段和毒性（区段和毒性（VirVir）区段。）区段。（1 1）T-DNAT-DNA区区 (12-24kb)(12-24kb) T-DNAT-DNA区段的两端均有相似的区段的两端均有相似的25bp2

10、5bp的特殊序列。的特殊序列。T TL L GGGGCACGATATATCACGATATATTCAATTTCAATTGTAAGTAAATATT TR R GGGGCACGATATATCACGATATATCGAGGTCGAGGTGTAAGTAAAAAAT-DNAT-DNA上编码基因主要有两类：第一类为编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，上编码基因主要有两类：第一类为编码冠瘿碱合成酶及分解代谢基因，另一类为诱发肿瘤的基因。另一类为诱发肿瘤的基因。冠瘿碱合成酶的基因具有真核生物的转录信号，冠瘿碱合成酶的基因具有真核生物的转录信号， T-DNAT-DNA整合到植物基因组后，整合到植物基因组后，他们能够在植

11、物体内表达。合成冠瘿碱，植物不能利用，农杆菌却能利用。他们能够在植物体内表达。合成冠瘿碱，植物不能利用，农杆菌却能利用。（2 2）毒性（）毒性（VirVir）区段）区段(30-40kb)(30-40kb) 毒性（毒性（VirVir）区段则编码能在细菌中表达的数个致瘤基因，表达的产物参与）区段则编码能在细菌中表达的数个致瘤基因，表达的产物参与T-T-DNADNA的加工和的加工和T-DNAT-DNA从细菌向植物的转移过程。从细菌向植物的转移过程。T-DNAT-DNA区段和毒性（区段和毒性（VirVir）区段在质粒）区段在质粒上的位置是彼此相邻的。其它结构部分的基因能够决定植物合成一种特殊的小分子上

12、的位置是彼此相邻的。其它结构部分的基因能够决定植物合成一种特殊的小分子物质物质冠瘿碱，还能够诱导冠瘿碱，还能够诱导TiTi质粒和质粒和RiRi质粒在不同的细菌之间的结合转移等。质粒在不同的细菌之间的结合转移等。VirVir区共有区共有6 6个基因操纵元，各带有不等的编码区。个基因操纵元，各带有不等的编码区。 农杆菌介导植物细胞转化过程示意图农杆菌介导植物细胞转化过程示意图一类是一元载体系统（整合载体系统），一类载体系统由一个共整合系统中间表达一类是一元载体系统（整合载体系统），一类载体系统由一个共整合系统中间表达载体与载体与受体卸甲受体卸甲TiTi质粒质粒载体载体组成组成。中间表达载体中间表达

13、载体是一种穿梭质粒。是一种穿梭质粒。同时与大肠杆菌同时与大肠杆菌质粒质粒pBR322pBR322结合起来组成既可以在大肠杆菌中复制又能在根癌农杆菌中复制的质粒结合起来组成既可以在大肠杆菌中复制又能在根癌农杆菌中复制的质粒。 卸甲（卸甲（disarmeddisarmed）载体：是指删除了）载体：是指删除了T-DNAT-DNA上的上的ONCONC基因和冠瘿碱合成酶等序列，而基因和冠瘿碱合成酶等序列，而使之失去了侵染能力的使之失去了侵染能力的TiTi质粒质粒。另一类转化体系是双元载体系统，由两个分别含另一类转化体系是双元载体系统，由两个分别含T-DNAT-DNA和和VirVir区的兼容性突变质粒区的

14、兼容性突变质粒构成的双质粒系统称为双元载体系统。构成的双质粒系统称为双元载体系统。二元载体系统是使用无毒的（二元载体系统是使用无毒的（disarmeddisarmed）TiTi质粒为载体。这种质粒为载体。这种TiTi质粒去掉了质粒去掉了T-DNAT-DNA区段中产生生长激素及生物碱的相关基因。因区段中产生生长激素及生物碱的相关基因。因T-DNAT-DNA核心基因的致瘤能力已经被缺失掉，所以进入植物细胞后，可以保证植物细胞核心基因的致瘤能力已经被缺失掉，所以进入植物细胞后，可以保证植物细胞能够正常分化，即能长出正常的植株来。能够正常分化，即能长出正常的植株来。它由两个分别含有它由两个分别含有T-

15、DNAT-DNA和和VirVir区的相容性突变区的相容性突变TiTi质粒即：微型质粒即：微型TiTi质粒（质粒（mini-Ti mini-Ti plasmidplasmid）和辅助）和辅助TiTi质粒（质粒（helper Ti plasmidhelper Ti plasmid）构成，）构成，T-DNAT-DNA和和VirVir基因在两个独立基因在两个独立的质粒上，通过反式激活的质粒上，通过反式激活T-DNAT-DNA转移到植物细胞基因组内。转移到植物细胞基因组内。（4 4）工程化）工程化TiTi质粒转入根癌农杆菌质粒转入根癌农杆菌 a.a.直接转化直接转化 从大肠杆菌中分离重组的质粒，以质粒从

16、大肠杆菌中分离重组的质粒，以质粒DNADNA直接转化根癌农杆菌。直接转化根癌农杆菌。 对对数生长期的根癌农杆菌离心收集后以数生长期的根癌农杆菌离心收集后以CaClCaCl2 2悬浮，置液氮中冷冻悬浮，置液氮中冷冻5min5min，加入，加入1 1g g的质粒的质粒DNADNA，再冻，再冻5min5min，迅速，迅速3737摄氏度熔化，促进摄氏度熔化，促进DNADNA进入细胞。进入细胞。 b.b.三亲交配法三亲交配法 利用细菌质粒的转移特性进行三亲交配的转移利用细菌质粒的转移特性进行三亲交配的转移 三亲交配由含微型三亲交配由含微型TiTi质粒的质粒的E EColiColi、含有助动质粒、含有助动

17、质粒pRK2013pRK2013的的E.ColiE.Coli和含有辅助和含有辅助TiTi质质粒的农杆菌组成。三细菌混合后产生菌间的接合转导。粒的农杆菌组成。三细菌混合后产生菌间的接合转导。pRK2013pRK2013可移入农杆菌，但由于可移入农杆菌，但由于不能自主复制而被丢失，其进入含有微型不能自主复制而被丢失，其进入含有微型TiTi质粒的质粒的E EColiColi后，可促进微型后，可促进微型TiTi质粒一起质粒一起或分别转移入农杆菌中。或分别转移入农杆菌中。四、植物基因工程中常用的选择标记和报告基因四、植物基因工程中常用的选择标记和报告基因1 1选择标记选择标记选择标记，必须符合两点要求：

18、选择标记，必须符合两点要求：选择标记最好能够抑制非转化植物细胞的正常生长，但并不杀死细胞；选择标记最好能够抑制非转化植物细胞的正常生长，但并不杀死细胞；选择标记最好有一种简便的方法可以检测其在转化细胞或植株中的表达。选择标记最好有一种简便的方法可以检测其在转化细胞或植株中的表达。（1 1）新霉素磷酸转移酶基因（简称为）新霉素磷酸转移酶基因（简称为NPTNPT基因）基因） NPT NPT 基因是植物基因工程中运基因是植物基因工程中运用很广泛的选择标记基因。用很广泛的选择标记基因。 它编码的新霉素磷酸转移酶基因使抗生素被磷酸化而失它编码的新霉素磷酸转移酶基因使抗生素被磷酸化而失活。因此活。因此NP

19、TNPT基因的表达可以使转化细胞对氨基葡萄糖苷类的抗生素如卡那霉素、基因的表达可以使转化细胞对氨基葡萄糖苷类的抗生素如卡那霉素、庆大霉素和庆大霉素和G418G418等产生抗性。等产生抗性。（2 2）双氢叶酸脱氢酶基因）双氢叶酸脱氢酶基因 (DHFR)(DHFR) 双氢叶酸脱氢酶基因与双氢叶酸脱氢酶基因与CaMV35SCaMV35S启动子拼接后转入植物，可使矮牵牛、烟草、油启动子拼接后转入植物，可使矮牵牛、烟草、油菜等多种植物对氨甲喋呤产生抗性。氨甲喋呤对植物具有很强的毒性。菜等多种植物对氨甲喋呤产生抗性。氨甲喋呤对植物具有很强的毒性。（3 3）潮霉素磷酸转移酶基因（）潮霉素磷酸转移酶基因（HP

20、THPT） 潮霉素磷酸转移酶基因构建成能在植物细胞中表达的嵌合基因后，导入植物，可潮霉素磷酸转移酶基因构建成能在植物细胞中表达的嵌合基因后，导入植物，可使植物对潮霉素具有抗性。潮霉素使植物对潮霉素具有抗性。潮霉素B B是对大多数植物有毒性的抗生素。是对大多数植物有毒性的抗生素。（4 4）氯霉素乙酰转移酶基因（简称为）氯霉素乙酰转移酶基因（简称为CatCat基因）基因）氯霉素乙酰转移酶基因（氯霉素乙酰转移酶基因（CatCat基因）编码氯霉素乙酰转移酶。这种酶能催化氯霉素形基因）编码氯霉素乙酰转移酶。这种酶能催化氯霉素形成成3-3-乙酰氯霉素、乙酰氯霉素、1-1-乙酰氯霉素和乙酰氯霉素和1 1，3

21、-3-二乙酰氯霉素，使氯霉素失活。所以将二乙酰氯霉素，使氯霉素失活。所以将CatCat基因构成可在植物中表达的嵌合基因，然后导入植物，可使通过放射性乙酰基对氯基因构成可在植物中表达的嵌合基因，然后导入植物，可使通过放射性乙酰基对氯霉素乙酰化，定量检测转基因的表达。霉素乙酰化，定量检测转基因的表达。2 2报告基因报告基因许多抗生素抗性基因都可以作为报告基因。除此以外，常用的报告基因还有：许多抗生素抗性基因都可以作为报告基因。除此以外，常用的报告基因还有： （1 1）GUSGUS基因基因 GUSGUS基因的全名是基因的全名是-葡萄糖苷酸酶基因。葡萄糖苷酸酶基因。这是目前应用最广的报告基因之一。这是

22、目前应用最广的报告基因之一。GUSGUS基因产物是基因产物是-葡葡萄糖苷酸酶，它可以将萄糖苷酸酶，它可以将5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚-葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸酯（酯（X-GluX-Glu）分解为蓝色的物质，也可以将）分解为蓝色的物质，也可以将4-4-甲基甲基- -伞形花伞形花酮酮-D-D-葡萄糖苷酸酯（葡萄糖苷酸酯（4-MUG4-MUG）分解为）分解为4-4-甲基甲基- -伞形花酮（伞形花酮（4-MU4-MU），），4-MU4-MU可以在可以在365nm365nm的光下激发产生荧光。因此通过的光下激发产生荧光。因此通过组织化学染色定位，可观察到组织器官中组织化学染色定位，可观察到

23、组织器官中GUSGUS基因的活性；基因的活性；或通过荧光分光光度计定量测定或通过荧光分光光度计定量测定GUSGUS基因的活性。基因的活性。 （2 2）荧光素酶基因）荧光素酶基因（luciferase,LUCluciferase,LUC） 荧光素酶在荧光素酶在MgMg2+2+和和ATPATP存在的条件下可以氧化荧光素，并产生荧光。可以通过荧存在的条件下可以氧化荧光素，并产生荧光。可以通过荧光计测定，也可以在暗处直接观察。目前用作报告基因的荧光素酶基因多来自于细光计测定，也可以在暗处直接观察。目前用作报告基因的荧光素酶基因多来自于细菌或萤火虫。菌或萤火虫。（3 3）冠瘿碱合成酶基因）冠瘿碱合成酶基

24、因 冠瘿碱合成酶基因是冠瘿碱合成酶基因是TiTi质粒或质粒或RiRi质粒上的一个基因，位于质粒上的一个基因，位于T-DNAT-DNA区段。它编码与区段。它编码与冠瘿碱（包括章鱼碱，胭脂碱，农杆碱）合成有关的酶。由于大多数植物中并不存冠瘿碱（包括章鱼碱，胭脂碱，农杆碱）合成有关的酶。由于大多数植物中并不存在这一类酶，故转化的植物细胞中出现冠瘿碱就意味着外源基因已经进入了，用菲在这一类酶，故转化的植物细胞中出现冠瘿碱就意味着外源基因已经进入了，用菲醌做荧光染料可以进行检测。醌做荧光染料可以进行检测。 （4 4）绿色荧光蛋白基因）绿色荧光蛋白基因 水母中分离的绿色荧光蛋白基因（水母中分离的绿色荧光蛋

25、白基因（GFPGFP）是当前在转基因技术中常用的标记基因）是当前在转基因技术中常用的标记基因。该蛋白可以在紫外激发下发出绿色的荧光。既可以方便进行定性检测，也可以进。该蛋白可以在紫外激发下发出绿色的荧光。既可以方便进行定性检测，也可以进行定量分析。行定量分析。 六、外源六、外源DNADNA导入植物细胞导入植物细胞 外源基因导入到植物的主要目的是赋予植物新的产物或性状，使之成为新品种外源基因导入到植物的主要目的是赋予植物新的产物或性状，使之成为新品种，其次是为了研究基因表达或用于基因作图和基因克隆。其中第一点对我们来说尤，其次是为了研究基因表达或用于基因作图和基因克隆。其中第一点对我们来说尤为重

26、要。为重要。外源基因导入到植物有三个关键因素是必需考虑的。外源基因导入到植物有三个关键因素是必需考虑的。首先要有适宜的基因（包括目的基因、选择标记基因或报告基因）和合适的选择条首先要有适宜的基因（包括目的基因、选择标记基因或报告基因）和合适的选择条件；件；其次是组织培养体系，要求植物细胞必需有效的再生成株，频率高，周期短；其次是组织培养体系，要求植物细胞必需有效的再生成株，频率高，周期短；第三是外源基因导入到植物的途径和方法，要求损失小、频率高且外源基因能稳定第三是外源基因导入到植物的途径和方法，要求损失小、频率高且外源基因能稳定的整合到基因组，并且具有正常的时空表达能力。的整合到基因组，并且

27、具有正常的时空表达能力。 1 1农杆菌参与的植物转化法农杆菌参与的植物转化法目的基因通过这种方法进入植物细胞要分几个步骤走。目的基因通过这种方法进入植物细胞要分几个步骤走。第一，将目的基因重组到适当的第一，将目的基因重组到适当的TiTi质粒载体或质粒载体或RiRi质粒载体或其它类型的载体上。根质粒载体或其它类型的载体上。根据所选用的载体系统进行重组。重组方法就是基因工程中常用的一些基本方法。据所选用的载体系统进行重组。重组方法就是基因工程中常用的一些基本方法。第二，目的基因随载体进入农杆菌（即转化农杆菌）。第二，目的基因随载体进入农杆菌（即转化农杆菌）。1)1)直接转化法直接转化法2 2）三亲

28、交配法。）三亲交配法。第三，目的基因进入植物细胞，即植物细胞的转化。根癌农杆菌获得了外源目的基第三，目的基因进入植物细胞，即植物细胞的转化。根癌农杆菌获得了外源目的基因后，接下来的工作就是要转化给植物细胞。目前常用的农杆菌转化植物的方法主因后，接下来的工作就是要转化给植物细胞。目前常用的农杆菌转化植物的方法主要有三种：要有三种：（1 1）创伤植株感染法（又叫做整株感染）创伤植株感染法（又叫做整株感染） 创伤植株感染法是指把新培养的根癌农创伤植株感染法是指把新培养的根癌农杆菌接种在植株的新鲜伤口部位，或把其注射到植物体内，再将感染部位的薄壁组杆菌接种在植株的新鲜伤口部位，或把其注射到植物体内，再

29、将感染部位的薄壁组织切下来访如选择培养基上筛选，最后再转移到诱导培养基上诱导愈伤组织再生成织切下来访如选择培养基上筛选，最后再转移到诱导培养基上诱导愈伤组织再生成完整的植株。这种方法又叫做体内转化法。完整的植株。这种方法又叫做体内转化法。（2 2）原生质体和农杆菌共培养法转化植物细胞）原生质体和农杆菌共培养法转化植物细胞 共培养法是指将毒性的农杆菌与正共培养法是指将毒性的农杆菌与正处于再生壁时期的原生质体一起培养，以促使植物细胞发生转化。然后将处理的原处于再生壁时期的原生质体一起培养，以促使植物细胞发生转化。然后将处理的原生质体培养成愈伤组织，在选择培养基上培养转化的愈伤组织，最后再生成转基因

30、生质体培养成愈伤组织，在选择培养基上培养转化的愈伤组织，最后再生成转基因植株。植株。（3 3）叶盘法转化植物细胞）叶盘法转化植物细胞 先将实验植物的叶片进行表面消毒，用经过消毒的无菌先将实验植物的叶片进行表面消毒，用经过消毒的无菌不锈钢打孔器从叶片上取下圆形叶片，即叶盘。然后接种上含有带外源基因的重组不锈钢打孔器从叶片上取下圆形叶片，即叶盘。然后接种上含有带外源基因的重组TiTi质粒的根癌农杆菌，置于培养基上培养质粒的根癌农杆菌，置于培养基上培养2 23 3天，再转移到含有抗生素的选择培养天，再转移到含有抗生素的选择培养基上进行选择培养，将筛选出的转化细胞再生成植株。叶盘法转化适用性很广，操基

31、上进行选择培养，将筛选出的转化细胞再生成植株。叶盘法转化适用性很广，操作简单方便，获得转基因植株的周期短而且重复性很好，能满足大工作量的要求，作简单方便，获得转基因植株的周期短而且重复性很好，能满足大工作量的要求，是一种很受欢迎的方法。是一种很受欢迎的方法。2 2其他转化方法其他转化方法可分为化学的和物理的方法两大类。可分为化学的和物理的方法两大类。（1 1）化学法）化学法 化学转化法是用特殊的化学药品处理细胞，促使原生质体摄取化学转化法是用特殊的化学药品处理细胞，促使原生质体摄取DNADNA。植。植物细胞的原生质体经过化学试剂（聚乙二醇物细胞的原生质体经过化学试剂（聚乙二醇PEGPEG、聚、

32、聚-L-L-鸟苷酸、磷酸钙及氯化钙等鸟苷酸、磷酸钙及氯化钙等）处理，便能够捕获外源）处理，便能够捕获外源DNADNA。在用过的化学转化法中，最常用的是聚乙二醇法（简称为在用过的化学转化法中，最常用的是聚乙二醇法（简称为PEGPEG法）。法）。PEGPEG法主要法主要是将原生质体悬浮于含有是将原生质体悬浮于含有DNADNA的介质中，用的介质中，用PEGPEG促使原生质体吸收促使原生质体吸收DNADNA。PEGPEG是一种高是一种高分子的多聚物，粘性较强，能维持分子的多聚物，粘性较强，能维持DNADNA附着在原生质体表面上的时间。附着在原生质体表面上的时间。（2 2）物理法）物理法 物理转化方法的

33、原理是基于许多物理因素可以影响细胞膜，有利于外物理转化方法的原理是基于许多物理因素可以影响细胞膜，有利于外源源DNADNA分子进入细胞，或者是造成细胞膜的机械损伤，促使外源分子进入细胞，或者是造成细胞膜的机械损伤，促使外源DNADNA直接进入细胞。直接进入细胞。常用的物理转化法有：常用的物理转化法有：1 1）电穿孔法）电穿孔法 电穿孔法的基本原理是在高压电脉冲作用下使新分离的原生质体的质膜上形成电穿孔法的基本原理是在高压电脉冲作用下使新分离的原生质体的质膜上形成可逆性的瞬间通道，从而使外源可逆性的瞬间通道，从而使外源DNADNA顺利进入原生质体内。这有两种不同的处理方式顺利进入原生质体内。这有

34、两种不同的处理方式，一种是采用较低的电压处理原生质体较长的时间，另外一种是采用高电压处理很，一种是采用较低的电压处理原生质体较长的时间，另外一种是采用高电压处理很短的时间。为了提高转化效率，通常把电穿孔法和短的时间。为了提高转化效率，通常把电穿孔法和PEGPEG法两者结合起来。法两者结合起来。电穿孔法简单方便，对细胞毒性低，转化效率高。缺点是容易造成原生质体有电穿孔法简单方便，对细胞毒性低，转化效率高。缺点是容易造成原生质体有较大的损伤，使植物再生率降低，要有较昂贵的专门仪器。提供较大的损伤，使植物再生率降低，要有较昂贵的专门仪器。提供500-1200V 1ms-5s500-1200V 1ms

35、-5s的脉冲。将植物细胞的细胞膜产生可逆性的穿孔。的脉冲。将植物细胞的细胞膜产生可逆性的穿孔。2 2）直接注射法（又叫微注射法）直接注射法（又叫微注射法） 用此法进行基因导入时，通常先将原生质体或培养的细胞固定在琼脂或低熔点用此法进行基因导入时，通常先将原生质体或培养的细胞固定在琼脂或低熔点的琼脂糖中，或者用聚赖氨酸处理原生质体使之附着在玻璃平板上，也可以通过一的琼脂糖中，或者用聚赖氨酸处理原生质体使之附着在玻璃平板上，也可以通过一固定的毛细管将原生质体吸着在管口，然后在显微镜下，将外源基因直接注射到细固定的毛细管将原生质体吸着在管口，然后在显微镜下，将外源基因直接注射到细胞中去。采用该法已在

36、烟草、油菜、苜蓿原生质体上获得了成功。显为注射装置由胞中去。采用该法已在烟草、油菜、苜蓿原生质体上获得了成功。显为注射装置由显微镜、显微操作仪和微注射仪组成。显微操作仪提供玻璃毛细管精确的位移，显显微镜、显微操作仪和微注射仪组成。显微操作仪提供玻璃毛细管精确的位移，显微注射仪可以将微注射仪可以将plpl的液体注入细胞。的液体注入细胞。3 3）基因枪法（又叫微射轰击法）基因枪法（又叫微射轰击法） 这是由桑弗德（这是由桑弗德（19871987年）建立的，基本原理是将年）建立的，基本原理是将DNADNA包裹于微小的金属钨或金颗包裹于微小的金属钨或金颗粒表面，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或

37、组织，使外源基因进入细粒表面，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入细胞的核中进行整合并表达。该法已使烟草、大豆、棉花、玉米等多种植物细胞得到胞的核中进行整合并表达。该法已使烟草、大豆、棉花、玉米等多种植物细胞得到转化，缺点是仪器昂贵。转化，缺点是仪器昂贵。4 4）低声强脉冲超声波法）低声强脉冲超声波法利用超声波对植物细胞壁的物理作用，使植物细胞接收外源利用超声波对植物细胞壁的物理作用，使植物细胞接收外源DNADNA。利用该法已经将。利用该法已经将GUSGUS基因导入小麦幼穗愈伤组织，将基因导入小麦幼穗愈伤组织，将CatCat基因导入甜菜、烟草原生质体，均得到瞬间基因导

38、入甜菜、烟草原生质体，均得到瞬间表达。处理的办法是将植物组织细胞和含外源基因的质粒表达。处理的办法是将植物组织细胞和含外源基因的质粒DNADNA混合于缓冲液中，用超混合于缓冲液中，用超声波处理，然后培养植物组织细胞并再生，从再生的植株中选择出稳定表达的转化声波处理，然后培养植物组织细胞并再生，从再生的植株中选择出稳定表达的转化植株。植株。 5 5）花粉管通道法）花粉管通道法 利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNADNA导入受精卵细胞，并进一导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中随着受精卵的发育而成为带转基因的新个

39、体。步地被整合到受体细胞的基因组中随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。转基因植物的鉴定主要集中在转基因植物的鉴定主要集中在DNADNA、RNARNA和目的蛋白三个层面上。和目的蛋白三个层面上。1.DNA1.DNA水平水平southern southern 杂交；斑点杂交（杂交；斑点杂交（dot blottingdot blotting）: :是在是在southern southern 杂交基础上发展而来杂交基础上发展而来的快速检测特异核酸的方法。其基本的原理是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进的快速检测特异核酸的方法。其基本的原理是通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸样品直接转移到杂

40、交膜上，然后再按样器上的核酸样品直接转移到杂交膜上，然后再按southern southern 杂交法进行杂交；杂交法进行杂交；PCRPCR。2. RNA2. RNA水平水平Northern Northern 杂交；杂交；RT-PCRRT-PCR（逆转录（逆转录PCRPCR）：先将）：先将mRNAmRNA转录成转录成cDNAcDNA，再设计一对引物，再设计一对引物扩增杂交分子。扩增杂交分子。3.3.蛋白质水平蛋白质水平western western 杂交杂交,elisa,elisa等。等。二、植物基因工程的受体细胞二、植物基因工程的受体细胞从植物基因工程的表达角度考虑，植物基因工程可以说是由两

41、大部分组成：从植物基因工程的表达角度考虑，植物基因工程可以说是由两大部分组成：受体系统；受体系统；载体系统。载体系统。目前植物基因工程所用的受体系统大致可分为三类：目前植物基因工程所用的受体系统大致可分为三类：植物细胞植物细胞原生质体原生质体植物组织。植物组织。（2 2）毒性（）毒性（VirVir）区段）区段(30-40kb)(30-40kb) 毒性（毒性（VirVir）区段则编码能在细菌中表达的数个致瘤基因，表达的产物参与）区段则编码能在细菌中表达的数个致瘤基因，表达的产物参与T-T-DNADNA的加工和的加工和T-DNAT-DNA从细菌向植物的转移过程。从细菌向植物的转移过程。T-DNAT

42、-DNA区段和毒性（区段和毒性（VirVir）区段在质粒）区段在质粒上的位置是彼此相邻的。其它结构部分的基因能够决定植物合成一种特殊的小分子上的位置是彼此相邻的。其它结构部分的基因能够决定植物合成一种特殊的小分子物质物质冠瘿碱，还能够诱导冠瘿碱，还能够诱导TiTi质粒和质粒和RiRi质粒在不同的细菌之间的结合转移等。质粒在不同的细菌之间的结合转移等。VirVir区共有区共有6 6个基因操纵元，各带有不等的编码区。个基因操纵元，各带有不等的编码区。另一类转化体系是双元载体系统，由两个分别含另一类转化体系是双元载体系统，由两个分别含T-DNAT-DNA和和VirVir区的兼容性突变质粒区的兼容性突变质粒构成的双质粒系统称为双元载体系统。构成的双质粒系统称为双元载体系统。二元载体系统