现代生物化学作业

1、动物科技学院 兽医硕士 冯柳柳 20131201811.举例说明原核基因表达调控的详细机制原核生物是一些由无真正的细胞核的细胞组成的单细胞或多细胞的低等生物。原核生物包括古菌（有时单独分类为古核生物）和细菌（真细菌，其中包含支原体和蓝藻门，有时“原核生物”一词仅指真细菌）。一般没有细胞内膜，没有细胞核膜，但依然有遗传物质，例如：DNA、RNA等。原核生物的DNA伴随些许蛋白质和核糖体，并以游离的形成存在于细胞质中。原核生物包含蓝绿菌和细菌，细菌一型态又可分为杆菌、球菌、螺旋菌。在双链DNA中，作为转录模板的链称为模板链（template strand）或反义链（antisense strand

2、）；而不作为转录模板的链称为编码链（coding strand）或有义链（sense strand），编码链与模板链互补，它与转录产物的差异仅在于DNA中的胸腺嘧啶（T）变为RNA中的尿嘧啶（U）。在含许多基因的DNA双链中，每个基因的模板链并不总是在同一条链上，亦即可作为某些基因模板链的一条链，同时也可以是另外一些基因的编码链。原核基因的表达包括转录和翻译两个过程。元和基因的表达调控主要表现在：转录水平的调节和转录后水平的调节。一、转录水平的调控1、因子的选择性使用 原核生物识别启动子序列的是因子。不同的因子可识别不同的启动子序列，E. coli主要使用70。在特殊的条件下，其它类型的因子被

3、表达或被激活。这些新的因子识别的是其它类型的启动子，其一致序列不同于70所识别的启动子，从而指导RNA pol启动一些新基因的表达。这样的调控系统使有机体能够对在特定条件下需要表达的多个基因进行统一的调控。 2、操纵子调控 一些功能相关的结构基因成簇存在，构成所谓的多顺反子，它们的表达作为一个整体受到控制元件的调节。控制元件由启动子、操纵基因和调节基因组成。调节基因编码调节蛋白，与操纵子结合而调节结构基因的表达。 3、 几种重要的操纵子 （1）乳糖操纵子 乳糖操纵子属于诱导型操纵子，其天然的诱导物是乳糖的异构体别乳糖，它既受到负调控，又受到正调控。其详细调控机制为：lacZ编码-半乳糖苷酶，催

4、化很少一部分乳糖异构化为别乳糖，绝大多数乳糖水解为半乳糖和葡萄糖；lacY基因编码半乳糖透过酶，其功能是使环境中的-半乳糖苷能透过细胞壁和细胞膜进入细胞内；lacA基因编码转乙酰基酶。转录时，RNA聚合酶首先与Plac结合，通过lacO向右，按lacZlacYlacA方向进行转录，每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因。 葡萄糖效应在有葡萄糖存在时，细菌优先利用环境中的葡萄糖，即使有诱导物乳糖的存在，乳糖操纵子也处于被抑制的状态，直到葡萄糖被消耗完后才能解除抑制，这时细菌才开始利用乳糖进行生长。这说明乳糖的存在仅仅是乳糖操纵子开放的必要条件，但还不是充要条件。 乳糖和葡萄糖同时存在的情况

5、下，乳糖操纵子也不能正常开放的原因是乳糖操纵子的开放还需要一种称为cAMP受体蛋白（CRP）的激活蛋白的正调控。只有在负调控不起作用、正调控起作用的条件下，乳糖操纵子才能开放。 （2）麦芽糖操纵子 麦芽糖操纵子控制几个与麦芽糖吸收和分解有关的酶基因的表达。受到调控的结构基因一个是malP编码麦芽糊精磷酸化酶促进麦芽糖运输到细胞内，另一个是malQ编码麦芽糖酶，将进入细胞的麦芽糖水解成葡萄糖。与乳糖操纵子相似的是，它也属于诱导型操纵子，也受到CAP-cAMP的激活。但与乳糖操纵子不同的是，作为诱导物的麦芽糖不是与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白的失活，而是与激活蛋白MalT结合，激活MalT。在没有葡

6、萄糖的条件下，被激活的MalT与CAP-cAMP一道打开麦芽糖操纵子，使malP和malQ得以表达。（3）大肠杆菌的色氨酸操纵子色氨酸操纵子是一种阻遏型的操纵子，它控制5种参与色氨酸合成酶基因的表达。色氨酸作为辅阻遏物与阻遏蛋白结合而阻止色氨酸操纵子的表达。当色氨酸含量低时，阻遏蛋白没有结合DNA的活性。这时，操纵基因区域便可以同RNA pol结合，转录得以进行，表达参与色氨酸合成的基因，补充细胞内色氨酸的含量；当色氨酸充足时，它作为辅阻遏物同阻遏蛋白结合后，会引起阻遏蛋白构象变化，使其能够同操纵基因结合，阻遏色氨酸合成基因的转录。色氨酸合成途径的终产物会通过阻遏转录的进行抑制该途径酶的合成。

7、二、转录终止阶段的调控 抗终止作用转录的终止依赖于终止子。但不同终止子的作用也有强弱之分，有的终止子几乎能完全终止转录；有的则只是部分终止转录，一部分RNA pol能越过这类终止序列继续转录。如果操纵子的结构基因群中间有弱终止子存在，则前后转录产物的量会有所不同，这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式。有的蛋白质因子能作用于终止子序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用，这些蛋白因子就称为抗终止因子。当然也有一些蛋白质因子能够促进终止子的作用。两种情况都可以用来调节基因的表达， 例：BglG蛋白的抗终止作用三、翻译水平上的调控1、反义RNA的正负调控 反义RNA是指与特定目

8、标RNA分子（通常是mRNA）因存在互补序列，而发生配对从而调节目标RNA功能的RNA分子。它通常是以一个基因编码链的部分序列为模板而转录而成，并不编码任何蛋白质。 反义RNA可参与DNA复制和基因转录的调控，而其对基因转录的调控主要在翻译水平上，少数在转录水平上，反义RNA可能起负调控，也可能起正调控的作用。 DrsA是在大肠杆菌中发现的又一种反义RNA，它既可以和hns mRNA互补配对，还可以和rpoS mRNA互补配对，但对这两种mRNA的翻译影响正好相反，前一种配对掩盖了hns mRNA5-端的核糖体结合位点（RBS），从而导致翻译受阻，后一种配对则暴露出rpoS mRNA上的RBS

9、，从而激活翻译。2、翻译控制 翻译控制是指转录产物本身的结构控制其翻译的过程。例如，pyrC基因编码嘧啶核苷酸合成途径中的二氢乳清酸酶，然而，细胞内嘧啶浓度的变化并不影响到pyrC基因的转录水平，但能影响到转录的序列。pyrC的转录可以从5-CCGG-3任何位置开始，但是，如果细胞内的嘧啶过量，转录倾向于从C2开始，这样的转录产物会形成一种茎环结构而将核糖体结合位点隐藏起来，致使翻译无法进行；相反，如果细胞内的嘧啶量有限，转录倾向于从G4开始，而这样的转录物不会形成掩盖核糖体结合位点的茎环结构，于是二氢乳清酸酶能得到正常的翻译。3、自体调控 自体调控是指一个基因产物对自己的基因表达产生激活或抑

10、制的现象。它既可以在转录水平上，也可以在翻译水平上进行。例如：T4噬菌体p32蛋白的自体调控 p32是由T4噬菌体基因组编码的一种蛋白质，它参与DNA重组、修复和复制，它与单链DNA结合的亲和力特高，这种性质与其功能有关。如果细胞内没有单链DNA结合位点，它便与自己的mRNA上位于起始密码子周围富含AT的序列结合，阻止自身的翻译。核糖体蛋白的自体调控 核糖体蛋白的基因组织成多个操纵子，大多数操纵子含有组成大、小亚基的核糖体蛋白的基因，某些与翻译有关的蛋白质的基因也包含在内。在每一个核糖体的操纵子上都有一个基因（总是核糖体蛋白基因）兼做调节基因，其蛋白质产物能够与自己的mRNA 5-端结合，从而

11、抑制自身的翻译。 4、mRNA的二级结构和稳定性对翻译的调控 mRNA的二级结构不仅可以影响到mRNA的稳定性，还会影响到核糖体结合位点的可得性。单核细胞增生性李斯特菌是一种能够导致食物中毒的人类病原菌，其毒性基因只有在菌体进入宿主内才会表达。控制毒性基因表达的源头在温度。PrfA 是一种激活蛋白，它负责激活与毒性有关的基因表达。有趣的是PrfA在37°C表达，在30°C则不表达，可是它的转录在两种温度下都能进行，看来控制的位点只能是在翻译的水平上了。原来在30°C或者更低的温度下，PrfA mRNA上的SD序列与其它区域配对形成链内双链，致使核糖体结合位点被掩盖

12、，翻译因此受到抑制；在37°C 下，配对区域热变性，SD序列暴露，核糖体可以结合，翻译便可以进行了。既然mRNA是翻译的模板，那么它的稳定性越高就会有更多的时间被翻译，因此，如果能够通过某种手段控制一种mRNA的稳定性，也就多了一种在翻译水平上调节基因表达的渠道。但由于原核细胞的mRNA本来就很不稳定，所以，在原核细胞利用此手段来调控基因表达的并不多见。RyhB RNA是大肠杆菌的一种小分子RNA，仅在铁饥饿的情况下表达。在铁供应不足的条件下，这种RNA与胞内6种与铁储存的蛋白质mRNA配对结合，形成双链区域，致使被结合的mRNA更容易被RNA酶E水解；但在高铁的情况下，RyhB R

13、NA的表达受阻，于是参与铁储存的蛋白质的mRNA稳定性提高，翻译效率因此提升。5、稀有密码子对翻译的影响dnaG、rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子，而这3个基因产物在数量上却大不相同，每个细胞内50个拷贝的dnaG蛋白，2800个拷贝的rpoD蛋白；40000个拷贝的rpsU蛋白。基因转录出来的三个蛋白相应的mRNA拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。研究dnaG序列发现其中含有不少稀有密码子。分别计算大肠杆菌中25种结构蛋白和dnaC、rpoD序列中64种密码子的利用频率，可以看出dnaG与其他两类有明显不同。很明显，稀有密码子AUA在高效表达

14、的结构蛋白及因子中均极少使用，而在表达要求较低的dnaG蛋白中使用频率就相当高。许多与dnaG一样含量少的蛋白，由于细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。2.详细说明明动物体内血糖降低时神经内分泌调控的生理生化机制当血糖含量降低时，促使胰岛A细胞释放谷氨酸盐。谷氨酸盐接着作用于AMPA和kainate型的促离子型谷氨酸受体，并使得细胞膜去极化，钙离子通道被打开，最终使得细胞质中的自由钙离子浓度增加，从而促进胰高血糖素的释放。肾上腺髓质分泌肾上腺素，同时启动下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴促进糖皮质激素的分泌。 胰高血糖素释放，糖原磷

15、酸化酶激酶和糖原磷酸化酶引起cAMP的级联作用，使丙酮酸激酶发生磷酸化，从而失去活性，抑制糖酵解。肾上腺素作用于骨骼肌细胞，促使糖原分解，使得肌糖原分解，血糖升高。 肾上腺素和胰高血糖素共同促进糖异生的作用：j诱导肝细胞中磷酸烯醇式丙酮酸的生成促进脂肪动员，脂肪酸分解乙酰CoA,乙酰CoA激活丙酮酸羧化酶。甘油：糖异生的原料。 肾上腺髓质激素：可以促进肝糖原分解，从而使血中游离脂肪酸增多，这些都有助于机体在应急状态下对能量的需要。同时，还可通过对胰岛B细胞上a受体作用，抑制胰岛素分泌，以利于血糖升高。糖皮质激素：诱导肝脏合成糖异生的四种关键酶，特别是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶。 促进肝外组织蛋白分

16、解，抑制外周组织对氨基酸的利用而异生成肝糖原，还能促进脂库动员。此外，糖皮质激素还有抗胰岛素的作用，通过肌肉、脂肪等组织对胰岛素的反应性，使外周组织对葡萄糖的利用减少，从而使血糖浓度升高。甲状腺激素：T3和T4可促进机体对糖的吸收和肝糖原的分解，同时可促进各组织加速对糖的利用。此外，甲状腺激素还可加强肾上腺素、胰高血糖素、皮质醇和生长激素升高血糖的作用。 糖异生与糖酵解作用的相互调节磷酸果糖激酶（PFK）和果糖-1、6-二磷酸酶的调节：当ATP和柠檬酸水平高时， PFK受抑制，降低糖酵解的速率，柠檬酸增加果糖-1、6-二磷酸酶活性，从而增加糖异生速率。3.详述在你论文设计中可能用到的现代生化与

17、分子技术的原理和流程 论文内容：减蛋综合征病毒的致病性结合论文设计，我的实验可能用到的生物化学和分子生物学技术主要有：引物设计、荧光定量PCR、ELISA1.引物设计：原理：PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在1530碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDN

18、A聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。4.引物3端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异

19、性与效率。5.引物3端不能选择A，最好选择T。 引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。7.引物自身及引物之间不应存在互补序列

20、。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8.引物5端和中间G值应该相对较高，而3端G值较低。 G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构

21、内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5端和中间G值相对较高，而3端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo6软件进行分析）9.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。 引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。3端也不能有形成任何二级结构可能。

22、10.扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。11.引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互性，就可以进行下一步的实验了。流程: 1.查文献，了解目的基因的测序情况，并汇总和个人工作相关的基因及其氨基

23、酸序列。然后，用clustal w2进行比对（该软件可以在线使用，）2.根据比对结果，可以确定出保守碱基在cDNA中的大体区域，再根据引物设计的要求来确定引物位置。3.大体确定引物扩增序列的长度，尽量可以包括所有的保守碱基。不过不宜太长。3.利用Primer 5.o分析确定上游和下游引物。 现在的软件都是直接给出引物序列的，不需要进一步的碱基配对，方向都是5-3荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特

24、异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR原理：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5端3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光定量PCR流程：样

25、品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30孵育10分钟后，于4下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块

26、。RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4下7000rpm离心5分钟。RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80待用。RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值

27、为1表示40g RNA/ml。样品RNA浓度计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40g /ml。具体计算如下：RNA溶于40l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40g/ml = 840g/ml 或 0.84g/l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35l，剩余RNA总量为：35l × 0.84g/l = 29.4g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。(2)变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中

28、，冷却至60，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10×MOPS电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS，pH 7.0、0.1M 乙酸钠、0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。56V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂

29、进胶至少23cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。样品cDNA合成反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2l2上游引物0

30、.2l3下游引物0.2l4dNTP0.1l5逆转录酶MMLV0.5l6DEPC水5l7RNA模版2l8总体积10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5l，37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80待用。样品管家基因（-actin）实时定量PCR-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3l按10倍稀释（加水27l并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。反应体

31、系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10l2阳性模板上游引物F0.5l3阳性模板下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6阳性模板DNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10l2内参照上游引物F0.5l3内参照下游引物R0.5l4dNTP0.5l5Taq酶1l6待测样品cDNA5l7ddH2O32.5l8总体积50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932分钟，然后93 1分钟，5

32、5 2分钟，共40个循环。模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量110×PCR缓冲液2.5 ul2MgCl2溶液1.5 ul3上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（941分钟；551分钟；721分钟）； 72延伸5分钟。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、