激光共聚焦技术ppt课件

1、激光共聚焦显微镜运用技术 蛋白的细胞器定位Confocal Laser Scanning MicroscopyZeiss LSM 510 META激光共聚焦显微镜的根本构造激光共聚焦显微镜的根本构造激光光源激光光源 冷却系统冷却系统 扫描器扫描器 光学安装光学安装 荧光显微镜系统荧光显微镜系统 图象存储与处置及控制系统图象存储与处置及控制系统针孔光栏针孔光栏 分光镜分光镜 发射荧光单色器发射荧光单色器 检测器检测器激光共聚焦显微镜在生物学中的运用激光共聚焦显微镜在生物学中的运用原位鉴定细胞或组织内生原位鉴定细胞或组织内生物大分子、察看细胞及亚物大分子、察看细胞及亚细胞形状构造细胞形状构造检测核

2、酸检测核酸检测蛋白质细胞定位检测蛋白质细胞定位检测细胞凋亡检测细胞凋亡细胞器的察看及测定细胞器的察看及测定检测细胞交融检测细胞交融察看细胞骨架察看细胞骨架检测细胞间缝隙衔接通讯检测细胞间缝隙衔接通讯检测细胞内脂肪检测细胞内脂肪活体细胞或组织功能的实活体细胞或组织功能的实时动态监测时动态监测实时定量测定细胞内实时定量测定细胞内Ca2+变化变化测定细胞内测定细胞内pH变化变化检测膜电位变化检测膜电位变化检测细胞内活性氧物种的检测细胞内活性氧物种的产生产生检测药物等跨膜进入组织检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位或细胞过程及其定位检测荧光共振能量转移检测荧光共振能量转移检测荧光漂白恢复检测荧光漂

3、白恢复荧光显微镜系统荧光显微镜系统激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜一样，但又有其特点。与常规荧光显微镜一样，但又有其特点。需与扫描器衔接。使激光能进入显微镜物需与扫描器衔接。使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器。测器。需有光路转换安装。即汞灯与激光转换，需有光路转换安装。即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。同时汞灯光线强度可调。荧光镜座要有防震动安装。荧光镜座要有防震动安装。激光共聚焦显微镜任务原理表示图激光共聚焦显微镜任务原理表示图激光经放大、激光经放大、分光后由物镜分光后

4、由物镜聚焦于焦平面聚焦于焦平面上，同时，焦上，同时，焦平面上被激光平面上被激光扫描的点扫描的点F所发所发出的一定波长出的一定波长的荧光经过检的荧光经过检测针孔光栏到测针孔光栏到达检测器，并达检测器，并成像于显示器成像于显示器上，得到相应上，得到相应的荧光图象。的荧光图象。激光共聚焦显微镜根本操作l获取共焦图像的步骤获取共焦图像的步骤l在在 VIS 方式中察看样品方式中察看样品l装入装入 LSM 配置配置l扫描图像扫描图像l保管图像保管图像不同厚度光切图像不同厚度光切图像 Z轴扫描轴扫描 时间系列扫描时间系列扫描 Z轴扫描时间系列扫描轴扫描时间系列扫描Z轴扫描、时间系列扫描轴扫描、时间系列扫描组

5、织和细胞样品中荧光的来源组织和细胞样品中荧光的来源l自发荧光自发荧光l荧光染色荧光染色l免疫荧光荧光抗体法产生荧光免疫荧光荧光抗体法产生荧光l外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光l酶致荧光酶致荧光荧光样品的制备要求荧光样品的制备要求l荧光标志反响的特异性强、荧光定位准确荧光标志反响的特异性强、荧光定位准确l坚持样品应有的构造形状完好性坚持样品应有的构造形状完好性l荧光信号的呼应准确、灵敏、具有可反复性荧光信号的呼应准确、灵敏、具有可反复性l荧光强度适宜荧光强度适宜l荧光稳定性好荧光稳定性好l样品的荧光分布均匀样品的荧光分布均匀l两种及两种以上的荧光信号之间荧

6、光光谱交叉两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除可以消除l图象背景干净、干扰杂质少图象背景干净、干扰杂质少荧光探针的种类及运用荧光探针的种类及运用l原位鉴定细胞或组织内生物大分子、察看细胞及亚原位鉴定细胞或组织内生物大分子、察看细胞及亚细胞形状构造细胞形状构造l检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白GFP、YFP等等l活体细胞或组织功能的实时动态监测活体细胞或组织功能的实时动态监测l实时定量测定细胞内实时定量测定细胞内Ca2+变化：变化：fluo-3/AM，fura-2荧光探针标志样品的过程荧光探针标志样品的过程l样品预处置样品预处置l给药、切片或细

7、胞标本的制备给药、切片或细胞标本的制备l荧光探针标志样品荧光探针标志样品百合花粉管钙离子浓度梯度检测o液体培育基中培育百合花粉o察看花粉管生长情况，长度大约为花粉粒直径的25倍，过长的花粉管会弯曲改动不利于察看。荧光探针oFluo-3/AMo属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。 oFluo-3/AM是fluo-3的一种乙酸甲酯衍生物， fluo 3/AM是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中被水解脱掉AM后，变成游离的fluo-3，因其不具备跨过完好细胞膜的特性因此停留在细胞内。o游离配体方式的fluo-3是非荧光性的，但是当它与Ca2结合后，构成具有荧光的fluo-3-Ca，是细胞荧

8、光强度添加40至80倍，而且其荧光强度与细胞内Ca2呈正相关，因此可以得到Ca2浓度。o另外Fluo 3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它方式的钙也有作用。save “projection Projection图图710. 7. 延续降温下生延续降温下生成成Ca2 + 荧光随时间变化的曲荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像线同时记录的荧光图像, 显示显示冬小麦胞内荧光有一样的变冬小麦胞内荧光有一样的变化趋势。化趋势。8. 延续降温下生成延续降温下生成Ca2 + 荧光随时间变化的曲线荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像同时记录的荧光图像, 显示春显示春小麦胞内荧光有一样的变化小麦胞内荧光有

9、一样的变化趋势。趋势。9. Fluo-3/ AM染色后染色后,静息态下冬小麦原生质体的静息态下冬小麦原生质体的三维重组图像。三维重组图像。10. Fluo-3/ AM染色后染色后,静息态下春小麦原静息态下春小麦原生质体的三维重组图像。生质体的三维重组图像。刘炜等，低温处置对冬、春小麦细胞Ca2 + 时空变化的影响，植物学报，2019，43 (12) :1218 1223 A B C D 图图 11-4 荧光蛋白扫描结果 A,B 检测 CFP 发现目的基因在核膜上表达 C,D 检测 CFP 发现目的基因在核膜上和胞浆中表达 目的蛋白细胞器定位察看n含有荧光蛋白的载体pA7-GFPn目的基因n洋葱

10、表皮nXbaI,SmaI,BamHI目的蛋白细胞器定位察看n含有荧光蛋白的载体pA7-GFPnCaMV 35S PromoternXhoI,NcoI,SalI,SpeInGFPn目的基因目的蛋白细胞器定位察看对提取的质粒，用目的基因的引物进展PCR鉴定，出现了目的片段。根据pA7-GFP Vector上提供的酶切位点，对重组质粒进展双酶切，酶切后进展电泳分析，也出现了目的片段，阐明目的片段曾经和质粒DNA重组。 图图3-9 pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定鉴定酶切：重组质粒酶切产物；酶切：重组质粒酶切产物；M：Marker DL 2000；PCR：重组质粒：重组质

11、粒PCR产物产物目的蛋白细胞器定位察看含含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约载体约20 L分别分别参与参与1.5 mL离心管中，分别参与离心管中，分别参与500 L的蒸馏水，两管分别标号的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。(2) 分别取分别取4片约片约1.5 cm*1.5 cm大小的洋葱表皮放入大小的洋葱表皮放入P1，P2。 (3)将将P1，P2管管盖翻开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。管管盖翻开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。(4)将将P1，P2管进展抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。管进展抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。(5)取取MS培育基并在其上铺上一层滤纸。培育基并在其上铺上一层滤纸。(6)取出取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在管中的洋葱表皮，将其铺在MS培育基的滤纸上，加少量的水培育基的滤纸上，加少量的水培育培育16小时。小时。目的蛋白细胞器定位察看 Bright GFP Merged TTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测A-C：GFP蛋白在洋葱表皮