基因工程复习重点

1、1 .核酸提取过程中，在酸性pH条件下DNA分配于有机组，RNA分配在水相;碱性条件下，DNA配于水相，RNA分配在有机相，所以提取DNA时，需要将苯酚平衡到pH7.8以上；提取RNA时，需要将苯酚平衡到pH4.5以下。2 .琼脂糖电泳中上样缓冲液有增大样品密度以确保DNA均匀沉淀到胶孔；使样品带颜色使加样容易；可以预知电泳速率。3 .荧光扩增曲线可以分为荧光背景信号阶段；荧光信号指数扩增阶段；平台期三个阶段。4 .大肠杆菌表达载体5个基本元素是：复制子，筛选标记，启动子，终止子，RBS组成。5 .一般来说基因文库是由：外源DNA片段，载体，宿主组成。补；琼脂糖凝胶电泳的染料是EB-澳化乙锭荧

2、光绿如蓝GelRed1 .下列哪一项论述是错的（D）A.几种互不相溶的液体所组成的乳浊液可以用离心方法分开B.液体中含有悬浮固体的悬浮液可以-C.液-液-固系统等非均一系混合物-D.酒精和水的混合物2 .下面的论述哪一项是正确的（D）A.从理论上来说无限提高风速可以有效增加洁净度B.对无菌的要求较低的时候可以利用通风柜代替超净工作台C.对安全性要求低用超净工作台代替生物安全柜D.闭环空气循环模式的超净工作台容易获得更好的洁净度3,下面关于核酸提取的论述哪一项是错误的（A）A,镁离子的沉淀效果最好，所以常用来沉淀核酸B.影响动物细胞DNA提取主要是蛋白质含量，DNA酶和水分含量C,影响植物DNA

3、提取主要是多糖和酚类物质D.DNA提取过程中最重要的是严格防止RNA酶的污染4 .关于大肠杆菌转化下面哪一项论述是错误的（A）A,内切酶和重组酶缺陷是转化的必要条件B,质粒的质量和浓度会影响转化率C.制备感受态试剂的质量会影响感受态细胞的转化效率D,电激转化可以转化较大的质粒，适用于所有的菌株5 .关于基因工程载体叙述哪一项是错的（C）A,都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制B,都很容易同细菌DNA分开并加以纯化C,都是环状的双链DNA结构D,都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的6-15CDBCBCADDB1,质粒不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘

4、关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞内稳定共同存在的现象。2,密码子偏好性：由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子，对于tRNA丰富的密码子称为偏爱密码子，而对应于tRNA稀少的密码子是稀有密码子3 .亚克隆基因文库：初步克隆的外源片段往往较长，含有许多目的基因片段以外的DNA片段，因此必须将目的基因所对应的已小段DNA找出来，这个过程叫亚克隆,获得多个克隆片段就成亚克隆文库。4 .内切酶的星号活力：在非标准条件下，也能切割一些与其特异性识别序列类似的序列得到不同的酶解反应片段的酶活性，则称星号活性，并识别序列类似的序列得到不同的酶解片段的酶活性则称星号活性。5 .同尾酶：切割不同的D

5、NA片段，但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶，这类酶来源各异，识别的序列也不同，但产生相同的粘性末端。6 .内切酶位点优势效应：某些限制性内切酶对同一底物的不同位点切割效率不同。7 .PCR:聚合酶链反应式是一种对特定DNA片段在体外进行快速扩增的方法，具有特异性强，灵敏度高，简洁快速，纯度要求低的反应特点。8 .感受态细胞(competentcell):理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。9 .热启动：在聚合酶链反应中先将模版同引物在高于两者变性温度的条件下处理一段时间，然后再加入酶和其他成分进行扩增反应，用以消除非特异性扩增产物的方式1 .什么是荧光扩增曲线，

6、一般来说分几个阶段在实时荧光定量PCR反应中，引入一种荧光化学物质，随着PCR化学反应的进行PCR产物不断积累，荧光信号强度也等比例增强，每经过一个循环，收集一个荧光信号强度。这样我们就可以通过荧光强度变化来监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。一般而言，荧光扩增曲线分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段，平台期2 ,简述微量移液器使用过程中设定容量值时的操作步骤当减少容量时缓慢调节到所需设定值，小心不要超过刻度，当增加容量时先调超过三分之一圈，再缓慢减少容量达到所需值，小心不要超过刻度3 .简述e互补筛选的原理和用途e互补是基于在两个不同的缺陷&半乳糖甘酶之间可实

7、现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖Iac操纵子中的IacZ基因编码&半乳糖甘酶，如果IacZ基因发生突变，则不能合成有活性的&半乳糖甘酶。对于只能编码N-端140个氨基酸的IacZ基因,其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复&半乳糖甘酶的活性，实现基因内互补，在生色底物5-澳-4-氨-3/引噪-&D-半乳糖甘培养基中形成蓝色菌落，而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使IacZ基因不表达而形成白色菌斑，这样就可以由颜色不同而区分重组子和非重组子4 .简述氧化钙感受态发我大肠杆菌转化的5个基本步骤及他们的作用a.把链接产物

8、加到感受态细胞bo冰上放置20min.。c.42C,90s。d.冰上2min。e.加SOC,37c培养45min5 .简述乙醇加盐离子进行沉淀核酸的基本原理乙醇是低极性，与水可以任意比例互溶，DNA溶液是双水合状态稳定存在的DNA,当加入乙醇夺取DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合沉淀，低温条件下分子运动大量减少，DNA易于聚合沉淀。在加入乙醇沉淀DNA时，加入一定浓度的NaAc或NaCb使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少分子间的同性排斥力，易于互相聚合而形成DNA的银沉淀。6 .如何提高外源基因在酵母中的表达水平第一提高和控制外源基因的转录水平，第二是提高外源基因表达盒在宿主中的拷

9、贝数，第三提高外源基因表达的因素。7 .如何理解限制性内切酶的位点优势效应酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同，在双酶切时要考虑底物点优势效应，例如EcoRI并不是随机切割心NA分子上5个识别位点，其中心NA在侧位点的切割速率比中间位点快10倍5、实验设计与分析题1、某一微生物基因组全场为4000,000bp,GC含量为60%,如果采用识别序列为GGATCC的BamHI的内切酶去切割该基因组，请问完全酶切后得到的片段大小约为多少bp?如果改用识别序列为GAATTC的EcoRI去切割该基因组，完全酶切后得到的片段的大小约为多少bp?答：由GC含量为60%,可知G=C=0.3,A=T

10、=0.2BamHI酶切后片段的大小为：1/(0.3x0.3x0.2x0.2x0.3x0.3)=3086bpEcoRII酶切后片段的大小为:1/(0.3x0.2x0.2x0.2x0.2x0.3)=6944bp2、张三把A和B两个DNA功能序列融合在一起进行表达，SDS-PAGE发现所表达得到的蛋白质分子量与B的DNA序列推算的蛋白质的分子量一致，就说是B单独表达了；而李四把A和B两个DNA功能序列融合在一起进行表达，所表达得到的蛋白质分子量与A+B的DNA序列推算的蛋白质分子量一致，就是说A和B表达成一个蛋白质了，请你解释这一现象？为什么会有这样的结果？答：张三设计的分泌表达，其表达的融合蛋白质

11、中A是作为信号肽，开始是翻译成A+B对应的蛋白质，但在分泌过程A对应的蛋白质在分泌过程中被切除掉，所以能获得B对应的蛋白质。李四设计的是融合表达，A和B两个DNA融合后形成了一个融合基因进行表达，翻译后获得A+B对应的蛋白质3、某同学根据以下DNA序列ATGGG.CCTCG来设计了以下一组引物F:5-GAATTCAC-3'R:5'-AAGCTTGT-3其分别在引物的5端设计了EcoRI和HindIII位点,目的是获得PCR产物后用相应的酶连接到相应的克隆载体上，有两个重大错误，是什么？如何纠正？答：第一个错误，引物没有加保护碱基，所以直接用内切酶消化不能产生粘性末端，应该增加保

12、护碱基，第二个错误两条引物没有形成互补，可以把其中一条变成互补链的。F:5"-NNNGAATTCATGGGACACCACCACCACCAC-3R:5"-NNNTTCGAACGAGGCCGACCAGCTCGCTGA-34.某同学用pET22B表达载体构建好两A和B基因的两个表达载粒，为了将两个质粒同时导入同一大肠杆菌中进行共表达，他吧两个质粒进行融合后转感受态细胞，经提取质粒检测发现转化菌株都只含有一种质粒。要么是A基因要么是B基因的质粒，他又改进实验先转化其中一个质粒然后把转化有一个质粒的菌株制备感受态细胞再进行转化第二个质粒。经检测转化菌株仍然只有一种质粒，请问这是什么原

13、因造成转化菌株具有一种质粒的？如何改进才能使两个质粒导入同一菌株中表达呢?这是质粒不相容造成的。更换具有不同复制子的质粒使两个质量相容才能导入同一宿主细胞。1 .离心机的类型？离心力的单位有两种，区别何在？按照是否具有温度控制系统可以分为：普通离心机和冷冻离心机。按照转头的离心速度可分为：低速离心机（4000rpm以下），高速离心机（20000rpm以下），超高速离心机（可以达到50000rpm）。按照转头的容量可以分为：大型离心机，小型离心机。离心机的离心力的单位：rpm和rcf。2离心机转速与相对离心力的换算公式为：rcf=11,18x（rpm1000）XRXg离心力不仅为转速的函数，也是

14、离心半径的函数。转速相同时，离心半径越长，离心力越大，需注意的是rcf的值是转速值的平方的函数。因此增加41%的速度就可以使rcf提高两倍。2,超净工作台空气循环模式有哪两种？净工作台由哪三个最基本的部分组成？开环模式：在每次循环中所有空气从外界采入并最终都回到环境中去，一般水平的超级工作台都采用开环模式。开环模式的超级工作台结构简单，成本低，适合一般水平流的超级工作台，但是风机和过滤器的负载较大，对其寿命产生不良影响。同时完全开环的空气循环的洁净效率不高，且外排的空气可能会携带部分样本中的细菌等，可能会对环境造成危害。通常只用于洁净要求较低的场合。闭环模式：空气部分流过工作区域后经导流孔重新

15、进去下一个循环过程，外排空气已经过一个外排高效空气过滤器的过滤。闭环空气循环模式实际上是不完全封闭的气流循环，70%的气体流过工作区域经导流孔重新进入下一个循环，较外界吸入的空气而言，这些气体还是比较纯净的，这样过滤器的负载就笑，寿命也较长。30%的气流通过一个外排高效空气过滤器后排放到外界，可以减少污染环境空气，生产成本较图O三个最基本的部分组成：高效过滤器，风机，箱体。3.微量移液器的使用注意事项有哪些？设定容量值、加样、放样注意事项有哪些？使用注意事项：调节容量不能过快，用力过大，动作要缓慢；使用完毕后调到最高值；未装上吸嘴的移液器不可直接吸取液体，吸嘴内有液体不能将移液器放平；操作移液

16、器要平稳，缓慢，释放按钮时不可以过快；移液温度不可以超过70度；加微量样品时将吸嘴伸到液面以下并打匀。设定容量值：当减少容量时，缓慢调到所需设定值，小心不要超过刻度；当增加容量时，先调超过三分之一的量，在缓慢减少容量达到所需值，小心不要超过刻度；加样：把按钮压至第一个停点；垂直握移液器，使吸嘴的前端进入液面的浅层，缓慢，平稳松开按钮。等一秒钟，然后将吸嘴提高液面。放样：将吸嘴口贴到容器内壁并保持1040度倾斜；平稳的把按钮压到第一个停点，等一秒后再把按钮压到第二个停点；压住按钮，同时提起移液器。4,核酸凝胶电泳的原理？对琼脂糖电泳影响的主要因素有哪些？基本原理：核酸分子是两性解离分子，在pH值

17、为3.5时碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极移动；当pH8.08.3时，核酸分子碱基上的氨基几乎不解离，而磷酸基团完全解离，所以这是核酸分子相当于带负电的阴离子，因此在电场中他就会向正极移动，所以核酸电泳中常用中性或偏碱性的缓冲液进行电泳，核酸分子中磷酸基团是呈离子化的，这个意义上讲DNA和RNA分子相当于带负电的阴离子，因此在电场中他就会向正极移动。对琼脂糖电泳影响的因素：DNA分子大小和构象；琼脂糖浓度；电场的电压和方向；电泳缓冲液的组成；澳化乙锭；样品的组分。5.PCR技术的原理？影响PCR的因素有哪些？PCR的衍生技术有哪些？原理：在生物

18、体内是DNA聚合酶的催化作用下进行DNA合成的，在一定条件下DNA模版在引物的引导下，以4种dNTP为底物，以3-0H师为起点合成一条互补的5-3的链。反应需聚合酶、模版、底物和引物。利用生物体内合成DNA的模式，在体外设计引物，然后以总DNA为模版与设计的引物，4种dNTP按适合量混合，加入耐热的DNA聚合酶和所需辅助试剂构成扩增系统，进行链式反应。PCR基本原理，变性、复性、半保留复制。因素：模板、引物、dNTP、缓冲液和Mg2+、酶的种类和浓度以及其他成分。技术：热启动PCR不又t称PCR原位PCR反向PCR6 .在核酸的提取中苯酚的使用原理是什么？需要注意什么？原理：苯酚可以喝细胞原浆

19、中蛋白质发生化学反应，形成变性蛋白质。在提取核酸的过程中苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性。利用苯酚处理后，离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白质变性存在于苯酚层中，从而达到核酸和蛋白质的分离。注意事项：苯酚不能简单地使用在核酸提取，因为这与苯酚的化学性质有关，也与核酸提取的要求有关，既要保证核酸的质量，对提取条件有一定的要求，也就是使用苯酚前必须对苯酚进行平衡。7 .核酸提取的原则是什么?第一，应保证核酸一级结构的完整性；第二，排除其他分子的污染8 .PCR的原理是什么？什么是平台期？它对PCR有什么影响？原理：在生物体内是DNA聚合酶的催化作用下进行DNA合成的，在一定条件下DNA模

20、版在引物的引导下，以4种dNTP为底物，以3_0H师为起点合成一条互补的5.3的链。反应需聚合酶、模版、底物和引物。利用生物体内合成DNA的模式，在体外设计引物，然后以总DNA为模版与设计的引物，4种dNTP按适合量混合，加入耐热的DNA聚合酶和所需辅助试剂构成扩增系统，进行链式反应。PCR基本原理，变性、复性、半保留复制。平台期：PCR反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再成指数增加，而进入线性增长期，即出现停滞效应”。影响：PCR产物增长慢或不增长，使PCR反应停滞。平台期的过早到来，可能会导致目标DNA产物的积累不能满足实验需要。9

21、.PCR系统的组成要素是什么？模板、引物、4种dNTP、Taq酶、反应缓冲液和Mg2+10 .热启动PCR的原理是什么?是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变形温度，从而提高PCR反应特异性。11 .基因工程常用载体有哪些？各有什么特点？常用载体：质粒、噬菌体载体、M13噬菌体载体、噬菌粒载体、柯斯质粒。特点：质粒：结构简单，能自主复制，独立存在并能稳定遗传，广泛存在各种微生物中，大多数质粒的宿主范围较窄，复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质。噬菌体载体：利用九噬菌体作载体，能插入的DNA长得多，而且包装的九噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高的多，但儿噬菌体载体的

22、克隆操作要比质粒载体复杂。M13噬菌体载体：单链DNA噬菌体的复制时以双链环状DNA为中间体，这种复制形式的中间体DNA可以像质粒DNA一样，在体外进行纯化和操作；单链和双链DNA噬菌体的两种DNA,他们都能够转染大肠杆菌细胞；单链DNA噬菌体载体不存在DNA分子包装限制问题；易测定外源DNA的插入方向；可产生能直接测序的单链噬菌粒载体：双链DNA即稳定，又高产，具有常规质粒的特征；免却了将外源DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一即繁琐又费时的步骤；由于载体足够小，故可以得到长达10kb的外源DNA区段的单链。柯斯质粒：具有人噬菌体的特性；具有质粒的特性；具有高容量的克隆能力；具有与同源序列

23、质粒进行重组的能力，广泛应用于基因组DNA文库的构建。12 .基因克隆的策略有哪些？基因文库的类型有哪些？特点如何？已知目的基因克隆的策略：即已知DNA序列基因的克隆和已知目的基因表达产物蛋白的序列。在这两种情况下一般采用PCR技术、PCR衍生技术或探针分子杂交技术分离克隆目的基因。有基因图位或标记、转座子的基因克隆的策略：可采用转座子标签法、T-DNA标签法以及图位克隆技术进行分离克隆目的基因。未知基因克隆的策略：差异表达序列；无差异表达的目的基因；随即克隆测序。狭义的基因文库又基因组DNA文库和cDNA文库之分。基因组DNA文库是存在于细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合，他就

24、是像图书馆库存放卷书一样。涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因文库后需要结合适当筛选方法从众多转化子菌落中筛选出含有某一基因的菌落，在进行扩增,将重组DNA分离、回收，获得目的基因。cDNA文库是由某一生物的特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经反转录形成的cDNA所构成得重组DNA克隆载体群体，其重组DNA分子所含的外源DNA不是基因组DNA。13 .什么是连接、酶切的双酶系统？由于连接酶活力依赖于ATP,对缓冲液的组成要求不是很严格，因此在很多内切酶的缓冲液中存在ATP的条件下仍能保持连接酶活性，因此连接酶和内酶切可以在同一反应体系中进行。它不仅可以降低背景，也可以

25、节约时间。但是它的使用有一定限制的，即连接的目的产物不能再被酶切下来。14 .什么是感受态细胞？影响制备感受态细胞质量的因素有哪些？在基因的分子操作中把经过处理并处于容易从周围环境中吸收外源DNA的生理状态的细菌称为感受态细胞。因素：受体细胞的感受态；受体细胞的限制酶系统；受体和供体染色体的同源性、细胞生长状态和密度、质粒的质量和浓度、试剂的质量；杂菌和杂DNA的污染。15 .大肠杆菌表达系统主要的三种类型是什么？具调控原理如何？有何异同？类型：Lac和Tac表达系统、T7表达系统、PL和PR表达系统。Lac和Tac表达系统原理：Lac表达系统是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计构建的表

26、达系统。具有多顺反子结构，基因排列次序为启动子一操纵基因一结构基因，具有正调节因子CAP和负调节因子lacI,。LacUV5突变体能够在没有CAP存在的情形下非常有效地起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控。Tac启动子是由trp的-35序列和lacUV5的-10序列拼接而成的杂合启动子，调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子。T7表达系统原理：是以大肠杆菌T7噬菌体具有的一套专一性非常强的转录体系中的元件为基础设计构建的表达系统，T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，调控方式有化学诱导型，温度诱导型，双质粒系统三种。在化学诱

27、导型中，用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式类似于lac表达系统。在温度诱导型中，PL启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。在双质粒系统中，一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因，调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型，但两个质粒的复制子和抗性标记不能相同。PL和PR表达系统原理：是以九噬菌体早期转录启动子PL和PR为核心构建的表达系统，调控原理和lac启动子相似，只是温度作为诱导子，不用加入化学诱导剂进行诱导。由人噬菌体PE启动子控制的cI基因的产物是PL和PR启动子转录的阻遏物，cl基因的产物在大肠杆

28、菌宿主中的浓度取决于一系列宿主于噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cl基因产生和消失时相当困难的，因此PL和PR的表达系统都选用温度敏感突变体CI857的基因产物来调控PL和PR启动子的转录，即较低温度时以活性形式存在，在较高温度时失活脱落。16 .原核表达系统表达元件的组成有哪些？复制子、筛选标记、SD序列、启动子、终止子、RBS。17 .利用大肠杆菌表达外源基因的策略有哪些？在表达载体中，根据具体需要对包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Taq标签，复制子，筛选标记和报告基因等元件进行针对性的选择；在表达类型上，根据具体需要对组成型表达、诱导调控表达或融合表达、非

29、融合表达等类型进行针对性的选择。另外，在细节上，还要注意氨基酸的亲疏水性、GC含量、基因的大小、包涵体的生成等问题。总之，没有万能的载体和表达类型，只有根据需要制定正确的策略，而策略的由来是建立在对他们了解的基础上的。18 .原核表达系统和真核表达系统有何优缺点？为什么要发展真核表达系统呢？原核表达系统的优缺点：周期短、易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高，但是，由于缺乏转录后加工机制，只能表达克隆的cDNA,不宜表达真核基因组DNA;由于缺乏适当的翻后加工机制，表达的真核蛋白质不能形成适当的折叠或进行糖基化修饰；表达产物的生物活性较低，表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需进行复杂的复性处理；很难表达大量的可溶性蛋白。真核表达系统的优缺点：克服大肠杆菌表达系统真核基因的缺点，蛋