第二章培养基灭菌

1、第二章培养基灭菌第1页，共71页。 微生物的热死灭动力学微生物的热死灭动力学 对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡（微生物体内蛋白质变性死亡（微生物体内蛋白质变性）的速率与残存的微的速率与残存的微生物数量成正比。生物数量成正比。 NkdtdNln(N/N0)=-Kt均相系统，它符均相系统，它符合化学反应的一合化学反应的一级反应动力学。级反应动力学。第2页，共71页。K（比热死亡速率常数）由两个因素决定1、微生物的种类和存在方式2、灭菌温度RTEeAK/RTEeAKd/ 第3页，共71页。RTEeAKd/ cKddtdcRTEeAK/Nkd

2、tdNln(N/N0 ) = -K t ln(C/C0 ) = -Kd t杂菌营养物质第4页，共71页。灭菌动力学的重要结论 高温短时灭菌高温短时灭菌对 取对数得：ln K = - E /RT + ln A K与E 、T有关，T，K对ln K = - E /RT + ln A 两边求T的导数 d (ln K)/ dT = E /RT2 K对T的变化率 细菌孢子热死灭反应的E很高，而大部分营养物质热破坏反应的E很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ ln(N/N0 ) = - K t ）；由于营养成分热破坏的E很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破

3、坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。RTEeAK/第5页，共71页。分批灭菌的设计第6页，共71页。分批灭菌的操作分批灭菌的操作分批灭菌：指每批培养基全部流入发酵罐分批灭菌：指每批培养基全部流入发酵罐后，在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维后，在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。持一定时间，再冷却到接种温度。第7页，共71页。 培养基分批灭菌过程中的温度变化情况培养基分批灭菌过程中的温度变化情况 第8页，共71页。第9页，共71页。第10页，共71页。分批灭菌操作的注意事项：分批灭菌操作的注意事项：(1)灭菌前检查灭菌前检查 检查发酵罐

4、及其管路的严密程度和清洁程度；检查蒸汽的质量和压力；检查净化空气的无菌程度等。检查发酵罐及其管路的严密程度和清洁程度；检查蒸汽的质量和压力；检查净化空气的无菌程度等。(2)进料进料 培养基原料经与水充分搅匀并粗滤后，边搅拌边进料，同时检查电动机负荷及传动设备运行是否正培养基原料经与水充分搅匀并粗滤后，边搅拌边进料，同时检查电动机负荷及传动设备运行是否正常。常。(3)进汽进汽 预先排除蒸汽管路的冷凝水和冷却管路的冷却存水；进汽后应继续搅拌，并使有预先排除蒸汽管路的冷凝水和冷却管路的冷却存水；进汽后应继续搅拌，并使有关灭菌管路都流通蒸汽，确保压力要求；在维持过程，使进汽和排汽平关灭菌管路都流通蒸汽

5、，确保压力要求；在维持过程，使进汽和排汽平 衡，确保罐压衡，确保罐压稳定，防止罐压下降导致泡沫上升；在最低限维持时间内大量进汽，促使料液产生较稳定，防止罐压下降导致泡沫上升；在最低限维持时间内大量进汽，促使料液产生较大翻动而露出液面等。大翻动而露出液面等。(4)灭菌后冷却灭菌后冷却 保温灭菌结束，依次关闭排汽阀和进汽阀，立即引入冷却水，并引入无菌空气保压。如果罐内泡沫保温灭菌结束，依次关闭排汽阀和进汽阀，立即引入冷却水，并引入无菌空气保压。如果罐内泡沫上升，可采用快速升压、大量排汽的办法处理，或开启罐顶压料用空气管阀门，略提高罐压，使泡沫消上升，可采用快速升压、大量排汽的办法处理，或开启罐顶压

6、料用空气管阀门，略提高罐压，使泡沫消除。除。第11页，共71页。 优点：优点：（1）设备造价低，不需另设加热、冷却装置；）设备造价低，不需另设加热、冷却装置；（2）操作要求低，可手动控制；）操作要求低，可手动控制；（3）适用于种子罐和小批量生产规模；）适用于种子罐和小批量生产规模；（4）适用于介质中含有大量固体物质的场合。）适用于介质中含有大量固体物质的场合。 缺点：缺点：（1）加热和冷却时间长，使发酵罐利用率低；）加热和冷却时间长，使发酵罐利用率低；（2）易发生过热而破坏营养成分的现象。）易发生过热而破坏营养成分的现象。第12页，共71页。三 分批灭菌的设计 要求绝对的无菌在工业上很难做到，

7、 因为： KtNoNlnktNoeNN=0，则e-kt= 0, 1/ekt= 0, ekt=, t= 因此，绝对的无菌很难做到。第13页，共71页。三 分批灭菌的设计 而且绝对的无菌也是不必要的，工程上只要求培养基中杂菌降低到合理的程度，然后进行细胞的培养，失败的可能性很小。 那么无菌程度降低到多少为好呢？ 有一个设计标准（判据）NoNN0：未灭菌培养基的含菌数N：灭菌后培养基中存活的菌体数第14页，共71页。三 分批灭菌的设计 培养基灭菌程度N / N0的要求因发酵系统而异。 某些培养过程，由于培养基中的基质不易被一般微生物利用,或温度、pH不适于一般微生物的生长，则对无菌程度要求低；但是有

8、一些培养过程对无菌程度要求高，例如抗生素的生产过程。第15页，共71页。三 分批灭菌的设计 常取N=10-3个/罐。 它的意义是：灭菌103次，存活一个活菌孢子的机会为1次。 例如：培养基100m3，含菌105个/ml,，要求灭菌后存活菌数10-3个/罐NoN1665310/1010010/10罐个罐个= 那么为计算方便 ln（N0/N ）=kt= 36.8 第16页，共71页。T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0Ln(N0/N1)Ln(N2/N)Ln(N1/N2)ln N0/N =36.8是总的判据，是由升温、保温、降温三段实现的ln （N0/N） =ln（ ） 1N

9、No21NNNN2NN 221NN1NNoln N0/N =ln +ln+ln第17页，共71页。三 分批灭菌的设计 分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。第18页，共71页。 间歇灭菌操作过程是由加热、保温和冷却这三个不同的阶段组成，灭间歇灭菌操作过程是由加热、保温和冷却这三个不同的阶段组成，灭菌的总时间为三个阶段时间之和，灭菌的总效果则为：菌的总时间为三个阶段时间之和，灭菌的总效果则为： 一般来说，完成整个灭菌周期需时约一般来说，完成整个灭菌周期需时约35h，其中各阶段的灭菌贡，其中各阶段的灭菌贡献

10、大致为：献大致为： 第19页，共71页。三 分批灭菌的设计 在灭菌过程中，必需设计出灭菌过程的操作时间和温度。 首先根据培养过程对培养基无菌程度的要求提出无菌判据ln （N0/N） ，然后依据所使用的灭菌设备，和设计出的灭菌温度和时间来计算出实际的ln（N0/N），看能否达到开始提出的无菌要求。第20页，共71页。 ln (N0/N1) = K(t1-t0) K是变数，t变化，T变化，K也变化。 NKdtdNdtKNdN10/101lnttRTEttdtAeKdtNNo升温段：T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0/N1)ln(N2/N)ln(N0/N1)第21

11、页，共71页。T灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0/N1)ln(N2/N)保温段：Ln(N1/N2)= K(t2-t1) T一定，K是常数。 ln(N1/N2)32/32lnttRTEdteANN降温段： 这三个判据中，保温段可以算出，升温段和降温段不好办，因为不知道T和t之间的函数关系。第22页，共71页。 是否有这样的函数关系呢？ 一些学者已经作出的常用的换热方式T-t关系式。第23页，共71页。 除了这种积分方式以外，工程上还常用图解积分法，即从设计的T-t数据换算成K-t数据，进行图解积分。三 分批灭菌的设计第24页，共71页。三 分批灭菌的设计例如：

12、某发酵罐分批灭菌最高温度120，保持5min，设计的温度和时间关系如下：（A=7.941038min-1；E=278441J/mol;R=8.28J/molK）t0103036435055586370102120140T30509010011012012011010090604433K00 00.030.363.593.590.360.03 0 0 0 t：min,T: , K:min-1 ,发酵罐60m3，N0=105个/ml，N=10-3问设计的T-t过程是否达到灭菌要求，如不能，应如何改进？ 第25页，共71页。三 分批灭菌的设计 解：先计算无菌程度的判据： N0/N=61015 ln

13、(N0/N )=36.3 K的数据值是由已知数据计算出的 根据已有的数据作出T-t和K-t图 36510106010RTEeAK/第26页，共71页。ln(N0/N3)=ln(N0/N1)+ln(N1/N2)+ln(N2/N3)= 36.3 ln(N1/N2)=Kt=3.595=17.95 第27页，共71页。三 分批灭菌的设计 t=34min以前和t=64min以后，K值太小，忽略不计. ln(N0/N1) +ln(N2/N3)按图解积分，求得 ln(N0/N1) +ln(N2/N3)=15.85 ln(N0/N3)= 没有达到N3=10-3的要求 , 残留菌数N3= N0e-Kt=N0 e

14、-33.8=1.2610-28.336434Kdt第28页，共71页。三 分批灭菌的设计保温阶段对杀死孢子的贡献:17.95/33.8=53%，而保温阶段时间只有5min。那么如何改进设计呢？(1) 增加保温时间，如果增加1min,那么 ln (N1/N2) =3.596=21.54 那么ln (N0/N3) =21.54+15.85=38.39， 达到了设计要求。 (2)可以升高灭菌温度。 间歇灭菌的升温阶段和降温阶段对灭菌的贡献相对较小，而对培养基中维生素类物质的破坏作用则可能很严重。应尽量缩短升温和降温阶段。第29页，共71页。例题：有一发酵罐，内装有30m3的培养基，在121下进行实罐

15、灭菌。设每毫升培养基中含有耐热的芽孢2107个，121时的灭菌速度常数为0.0287(1/秒)。试说明当灭菌失败几率为0.001时的所需灭菌时间的求算方法。若不考虑加热升温和冷却降温段对灭菌的贡献，计算所需灭菌时间。第30页，共71页。解：N0/N=301062107/10-3=61017lnN0/N=ln61017=ln6+17ln10=40.93 因忽略升温降温阶段对灭菌的影响，故lnN0/N=Kt=40.93K=0.0287t=1426.1（s）第31页，共71页。连续灭菌的设计第32页，共71页。第33页，共71页。第34页，共71页。第35页，共71页。第36页，共71页。第37页，

16、共71页。连续灭菌的操作连续灭菌的操作 指培养基在发酵罐外连续不断的加热、维持和冷却，然后进入发酵罐。指培养基在发酵罐外连续不断的加热、维持和冷却，然后进入发酵罐。连续灭菌的操作注意事项：连续灭菌的操作注意事项：(1)空罐灭菌空罐灭菌 采用大进汽方式进汽，以使罐顶各开孔部位的有关采用大进汽方式进汽，以使罐顶各开孔部位的有关管路阀门彻底灭菌，再关小排汽保持压力管路阀门彻底灭菌，再关小排汽保持压力160180千帕千帕(128130左右左右)，流通蒸汽灭菌，流通蒸汽灭菌30分钟，并在稍开进汽阀分钟，并在稍开进汽阀和排汽阀的条件下闷罐灭菌和排汽阀的条件下闷罐灭菌30分钟。灭菌结束，将罐压降至分钟。灭菌

17、结束，将罐压降至低于空气过滤器压力，立即进无菌空气保压，并通冷却水低于空气过滤器压力，立即进无菌空气保压，并通冷却水冷却。冷却。加热器、维持罐和冷却器也先进行灭菌。第38页，共71页。(2)连续进蒸汽加热连续进蒸汽加热 加热前，先将物料预热至加热前，先将物料预热至6075，以减少蒸汽加热时水汽的撞击，以减少蒸汽加热时水汽的撞击声。声。 加热时务必保持总蒸汽压达加热时务必保持总蒸汽压达500千帕，使其接近预热罐出口压力千帕，使其接近预热罐出口压力(600千帕千帕)，培养基流速才均匀稳定，否则影响灭菌质量。，培养基流速才均匀稳定，否则影响灭菌质量。 维持罐罐温维持在维持罐罐温维持在126132，维

18、持罐罐压为，维持罐罐压为400千帕，一般千帕，一般5分钟分钟可以达到彻底灭菌要求。可以达到彻底灭菌要求。(3)灭菌后冷却灭菌后冷却 物料冷却前，冷却管内应先充满料液。喷淋冷却至物料冷却前，冷却管内应先充满料液。喷淋冷却至4050 ，再将，再将料液排入空罐。料液排入空罐。 排出无菌料液务必防止排出无菌料液务必防止“倒吸倒吸”。即物料管路灭菌后，管内蒸汽压。即物料管路灭菌后，管内蒸汽压稍降，应立即使无菌料液充满管道，再喷淋冷却，以免管道冷却后压力稍降，应立即使无菌料液充满管道，再喷淋冷却，以免管道冷却后压力急剧下降造成负压，外界空气从管路渗漏处窜入。急剧下降造成负压，外界空气从管路渗漏处窜入。 第

19、39页，共71页。 耐热性物料和不耐热性物料可分开灭菌。 糖和氮源分开灭菌。第40页，共71页。连续灭菌优点：连续灭菌优点： （1）容易达到较高的温度，缩短灭菌时）容易达到较高的温度，缩短灭菌时间，减少营养物质的破坏；间，减少营养物质的破坏； （2）操作条件恒定，灭菌质量稳定；）操作条件恒定，灭菌质量稳定； （3）易于自动控制，降低劳动强度；）易于自动控制，降低劳动强度； （4）系统避免反复加热和冷却，提高热）系统避免反复加热和冷却，提高热利用率。利用率。第41页，共71页。第42页，共71页。 四、连续灭菌反应器的流体流动模型 在设计连续灭菌设备时，必须认识到并不是培养基 的每一质点都在反应

20、器中停留同样的时间。 第43页，共71页。活塞流（理想）滞流，V=0.82Vmax湍流,V=0.5Vmax实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点（微团）的流速不同（有流速分布）。第44页，共71页。 实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点（微团）的流速不同（有流速分布），这就必然造成物料间的（轴向）混合，这样就不能保证物料先进的先出，后进的后出，那么有的物料灭菌时间长，有的灭菌时间短，有的物料达到了灭菌要求，而有的没有达到，由此我们在设计反应器时，一定考虑到这个现象，引入的概念。第45页，共71页。第46页，共71页。数学模型的构建数学模型的构建 返混现象返混现象 ： 反应器中

21、停留时间不同的物料之间的混合称为返混。 返混是个复杂的现象，到目前为止还不能用数学解析的方法表示出来，在实际的工程中，又要涉及到这个问题，怎么办？ 把这个复杂的现象用数学模型表示，使简单的模型和复杂的系统具有等效性。第47页，共71页。 按照返混的程度，在化学工程中建立了两种理想的连续流动反应器模型。 连续搅拌模型连续搅拌模型（CFSTR）和活塞流和活塞流模型模型（PFR）反应器反应器第48页，共71页。 在实际反应器中，其返混程度总是处于两种模型之间。搅拌良好的反应器接近于CFSTR，管式反应器和填充床反应器返混程度较小，接近于PFR反应器。 这两种模型都可用于培养基灭菌。第49页，共71页

22、。（1 1）PFRPFR模型模型（活塞流）plug flow reactor 物料沿同一方向以相同速度向前流动，在流动方向上没有物料返混，所有物料在反应器中的停留时间都是相同的。（长径比很大的管式反应器，没有弯头、阀门、管件、接近于PFR模型） 第50页，共71页。（1）PFR模型模型（活塞流模型）plugflowreactor恒温热灭菌状况：恒温热灭菌状况：1 同一截面上活孢子浓度（N）相等，热死灭速率相等。2 沿流动的方向，活孢子浓度（N）下降，热死灭速率也相应下降。NkdtdN第51页，共71页。（1）PFR模型（活塞流模型）plug flow reactor 求算N、t的数学关系 方法

23、：对反应器进行物料衡算。 培养液通过PFR全反应器所达到的灭菌程度的计算： 先对微元物料衡算，再沿流动方向的长度积分。第52页，共71页。物料衡算通式：物料衡算通式：进入量进入量=排出量排出量+热死灭量热死灭量dv足够小，可以认为在此微元内足够小，可以认为在此微元内N相等，热死灭速率处处相等，相等，热死灭速率处处相等，是均一体系。是均一体系。 dv=Adl整理得整理得：结论：结论：活塞流的灭菌效果与间歇反应器的分批灭菌效果相同。反活塞流的灭菌效果与间歇反应器的分批灭菌效果相同。反应速度增加，但是可以节约升降温时间。应速度增加，但是可以节约升降温时间。KNdtdN第53页，共71页。（2）CFS

24、TR模型（全混流模型）Continued flow Stirred Tank Reactor第54页，共71页。连续搅拌罐反应器的结构基本上与分批操作的搅拌罐反应器相同。两者的根本差别在于：1 连续操作。2 反应器内料液组成（等于出料液组成），不随时间而变化。搅拌强烈的实际连续反应器（机械搅拌、气流或液流搅拌）可以接近于CFSTR特性。 第55页，共71页。（2）CFSTR模型（全混流模型） 求算N、t 的数学关系 方法：对整个反应器进行物料衡算。 物料衡算通式： 进入量=排出量+热死灭量 NoNKt11第56页，共71页。CFSTR和PFR灭菌效果的比较NoNKt11PFR:NoNe-kt=

25、要达到相同的灭菌效果， 即需要的灭菌时间长？NoN一定，那么哪一种反应器结论：CFSTR需要的时间长。CFSTR：第57页，共71页。（3）多级全混流釜模型MultipleCFSTRsinseries 在工程实践中常将几个CFSTR反应器串联使用，来接近PFR的效果。 tN0活塞流多釜串联 多级全混流釜串联模型及其浓度分布图第58页，共71页。MultipleCFSTRsinseries1111KNoN11122KNNnKNoN)1 (1 为每个串联反应器的平均停留时间。如果让多级全混流釜模型有PFR效果，则：nKNoN)1(1Kte1=t=n，（1+K）n=ekn当= 0 ，n=时，有活塞流

26、的效果。第59页，共71页。（4）扩散模型返混：是不同反应时间的物料之间的混合。PFR：返混程度最小CFSTR：返混程度最大长/径，返混程度长/径，返混程度 实际操作的大部分反应器都介于这两种理想的反应器之间。第60页，共71页。 扩散模型 活塞流 扩散流动 流体在管内流动，由于分子扩散和涡流扩散的作用使一部分流体质点返混了回去，这个过程简化为在活塞流动中叠加了一个与流动方向相反的扩散。第61页，共71页。费克定律：扩散通量（沿轴方向）=DeDe：轴向扩散系数 cm2/sC：质点浓度 个/cm3 L：扩散距离 cm扩散通量的物理意义： 单位时间内，单位面积通过的质点个数，单位：个/s cm2 。dldc第62页，共71页。 把这两种流动叠加，对进出任一微元体积的活孢子数进行衡算。 求算N、t 的数学关系。 物料衡算通式： 进入量=排出量+热死灭量第63页，共71页。2/22/22/0)1 ()1 (4NPeNPeNPeeeeNN解得： 其中=PeNK41，Npe=DeLu可见 不但是K的函数，而且在很大程度上取决于Npe，后者是返混程度的一个量度。这样的公式应用起来太麻烦，有学者作了算图，将灭菌程度 对应于K作图，以Npe= 为参数。 NoNNoNDeLu第64页，共