生物化学实验：微量凯氏定氮法

1、生物化学实验微量凯氏定氮法实验内容 一、目的和要求一、目的和要求 二、实验原理二、实验原理 三、方法步骤三、方法步骤 四、思考题四、思考题一、目的和要求一、目的和要求1. 学习微量凯氏定氮法的原理2. 掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括 标准梳酸铵含氮量的测定、未知样品的 消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等 天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）的含氮量用凯氏天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）的含氮量用凯氏定氮法来测定。当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、定氮法来测定。当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反二氧化碳及水。氮转变出

2、的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。剂过氧化氢也能加速反应。二、实验原理二、实验原理 1.RCHNH1.RCHNH2 2COOH + 3HCOOH + 3H2 2SOSO4 42CO2CO2 2+ 2SO+ 2SO2 2+ 4H+ 4H2 2O + NHO + NH3 3 2.2NH 2.2NH3 3 + H + H2 2SOSO4 4 (NH (NH4 4)

3、)2 2SOSO4 4 消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱（消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱（NaOHNaOH）碱化消化）碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量无机酸无机酸(H(H3 3BOBO3 3) )溶液中，然后用标准酸（盐酸）溶液进行滴定，溶液中，然后用标准酸（盐酸）溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。准确测定氨量，从而折算出含氮量。3 3、(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 + 2NaOH Na + 2NaOH Na2 2SOSO4 4 + 2NH + 2NH3 3 +2H +2H2

4、2O O 4 4、3NH3NH3 3 + H + H3 3BOBO3 3 (NH (NH4 4) )3 3BOBO3 3 + 3H + 3H2 2O O5 5、(NH(NH4 4) )3 3BOBO3 3 + 3HCl 3NH + 3HCl 3NH4 4Cl + HCl + H3 3BOBO3 3本法适用的范围为本法适用的范围为0.2-1.0mg0.2-1.0mg氮。相对误差应小于氮。相对误差应小于2%2%二、实验原理二、实验原理三、方法步骤三、方法步骤 测定某一固体样品中的含氮量，是按100克该物质的的干重所含的氮克数来表示（%）。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。操作时先将样品磨细，

5、在称量瓶中称入一定量的样品，再置于105的烘箱内烘烤1小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重。按上述操作，每烘干1小时后重复称量一次，直至两次称量数值不变，即达到恒重为止。 （一）、样品处理（一）、样品处理 准备4个50mL的凯氏烧瓶，并标号，向第1、2号烧瓶内各加入200mg固体粉末。注意，加入固体样品应加至烧瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶颈上。向3、4号烧瓶加入2mL水，作为空白对照，测量试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。 在每个烧瓶中加入约300mg硫酸钾-硫酸铜混合物，再用移液管加入消化液5mL，加入1颗玻璃珠以防止暴沸。将以上4个烧瓶放到消化架上进行消化。 （二

6、）、消化（二）、消化 待消化液变成褐色后，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即完成（固体样品约需3小时）。（二）、消化（二）、消化（三）、蒸馏（三）、蒸馏 仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。一般仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。一般洗涤是先用水洗净棒状玻塞周围，每次实验后要洗洗涤是先用水洗净棒状玻塞周围，每次实验后要洗去氢氧化钠溶液，以防样品加入时立即放氨。使用去氢氧化钠溶液，以防样品加入时立即放氨。使用前全部蒸馏装置必须用水蒸汽充分洗涤。用水蒸汽前全部蒸馏装置必须用水蒸汽充分洗涤。用水蒸汽洗涤蒸馏器的目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。洗涤蒸馏器的目的在于洗去冷凝管中可

7、能残留的氨。对于处于使用状态的仪器（尤其是正在测定中的仪对于处于使用状态的仪器（尤其是正在测定中的仪器），加样前使蒸汽通过器），加样前使蒸汽通过1 12min2min即可，对于较长即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽时间未使用的仪器，必须用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸的硼酸- -指示剂混合液颜色合格为止。指示剂混合液颜色合格为止。（三）、蒸馏（三）、蒸馏1.1.仪器的洗涤仪器的洗涤 加样前先撤火1并务必打开夹子，否则，样品会被倒抽到反应器外。取下棒状玻塞，用吸管吸取5mL消化液，细心地插到反应器小玻杯的棒状玻塞的下方。这步必须切实做到，以免加碱后氨立即挥发逸走，让反应液流入

8、反应室中，塞上棒状玻塞，取1只盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，放在冷凝器之下口，冷凝器下口必须在硼酸液面之下。此锥形瓶在加碱液（40%氢氧化钠溶液）前或者也可以加样品之前就放在冷凝管下口，并使下口浸入，目的是保证全部吸收氢氧钠溶液与样品接触时放出的氨。2.2.样品以及空白蒸馏样品以及空白蒸馏 用量筒向小玻杯加入用量筒向小玻杯加入10mL 40%10mL 40%氢氨化钠，氢氨化钠，加完后，轻轻地旋转着向上提起棒状玻塞加完后，轻轻地旋转着向上提起棒状玻塞, ,使使碱液慢慢流入反应室，在碱液尚未守全流入碱液慢慢流入反应室，在碱液尚未守全流入时，将玻塞盖紧，向小玻杯中加入约时，将玻塞盖紧，向小玻杯中加

9、入约5mL5mL蒸馏蒸馏水。再轻提玻塞，使一半蒸馏水流入反应室，水。再轻提玻塞，使一半蒸馏水流入反应室，另一半留在玻杯中水封。另一半留在玻杯中水封。2.2.样品以及空白蒸馏样品以及空白蒸馏全部蒸馏完毕后，用全部蒸馏完毕后，用0.01024mol/L0.01024mol/L标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸的氨量，直至硼酸- -指示剂混合液指示剂混合液由绿色变回茶褐色，即为滴定终点。由绿色变回茶褐色，即为滴定终点。蛋白氮蛋白氮= =总氮总氮- -非蛋白氮非蛋白氮蛋白质含量（克蛋白质含量（克/%/%）= =蛋白氮蛋白氮6.256.253.3.滴定滴定4 4、计算、计算1.1.指出下列试剂的作用：指出下列试剂的作用：（1 1）消化含氮样品时使用的消化液、硫酸钾及硫）消化含氮样品时使用的消化液、硫酸钾及硫酸铜粉末。酸铜粉末。（2 2）蒸馏滴定中的）蒸馏滴定中的40%40%