DNA自身抗体的研究及其临床应用

1、 自身免疫病是一大类以产生各种各样自身免疫病是一大类以产生各种各样的自身抗体为特征的全身或局部性疾病，如的自身抗体为特征的全身或局部性疾病，如系统性红斑狼疮（系统性红斑狼疮（SLESLE）、类风湿性关节炎）、类风湿性关节炎（RARA）、皮肌炎、硬皮病以及免疫性不孕症）、皮肌炎、硬皮病以及免疫性不孕症等，其较高的发病率和严重的危害程度越来等，其较高的发病率和严重的危害程度越来越受到医学界的关注，由于不同的自身免疫越受到医学界的关注，由于不同的自身免疫病具有不同的自身抗体谱，因此自身抗体的病具有不同的自身抗体谱，因此自身抗体的研究对自身免疫病的诊断、鉴别诊断、治疗研究对自身免疫病的诊断、鉴别诊断、

2、治疗及疗效监测均有重要的意义。及疗效监测均有重要的意义。 迄今为止，已发现的自身抗体将近迄今为止，已发现的自身抗体将近100100种，应用于临床的自身抗体也已达数十种，应用于临床的自身抗体也已达数十种。新的自身抗体还在不断的被发现和应用。种。新的自身抗体还在不断的被发现和应用。 DNADNA自身抗体作为一种经典的且被广泛自身抗体作为一种经典的且被广泛应用的自身抗体，在自身免疫病的研究中发应用的自身抗体，在自身免疫病的研究中发挥了重要的作用。挥了重要的作用。 但但DNADNA作为一种特殊的自身抗体，还存作为一种特殊的自身抗体，还存在许多未解之谜，因此，人们对在许多未解之谜，因此，人们对DNADN

3、A自身抗自身抗体的研究和探索始终没有停止。体的研究和探索始终没有停止。 本次讲座主要讨论一下本次讲座主要讨论一下DNADNA抗原以及其抗原以及其相对应的相对应的DNADNA自身抗体的研究和临床应用。自身抗体的研究和临床应用。DNADNA自身抗体的研究进展自身抗体的研究进展南京军区福州总医院南京军区福州总医院全军检验中心全军检验中心兰兰 小小 鹏鹏一、DNADNA抗原的分子特性抗原的分子特性 1.DNADNA分子的基本构象：分子的基本构象： 右手双螺旋（右手双螺旋（B-DNAB-DNA） 左手双螺旋左手双螺旋DNADNA（Z-DNAZ-DNA） B-DNAB-DNA和和Z-DNAZ-DNA又称双

4、链又称双链DNADNA（double stranded DNA ,ds-DNA)double stranded DNA ,ds-DNA)或或天然天然DNADNA（native DNA,nDNA)native DNA,nDNA) 单链单链DNA(single stranded DNA,ss-DNA)DNA(single stranded DNA,ss-DNA)或称变性或称变性DNADNA 2.DNA2.DNA分子的抗原特性分子的抗原特性) )不同构象的分子之间的抗原性差别甚不同构象的分子之间的抗原性差别甚 大，但又彼此交叉，还可互相转变。大，但又彼此交叉，还可互相转变。）DNADNA分子具有多抗

5、原决定簇的特点：与抗体结合时的亲和力较高。分子具有多抗原决定簇的特点：与抗体结合时的亲和力较高。）DNADNA抗原具有多聚阴离子特性：易产生非特异结合反应。抗原具有多聚阴离子特性：易产生非特异结合反应。) ds-DNA) ds-DNA的抗原决定簇存在于的抗原决定簇存在于ds-DNAds-DNA分分 子的构象之中。子的构象之中。）DNADNA抗体与抗体与DNADNA的结合能力与的结合能力与DNADNA抗原的分子量有一定的关系，分子量越大，结合率越高。只有抗原的分子量有一定的关系，分子量越大，结合率越高。只有35bp35bp以上以上的片段才能有效地与抗的片段才能有效地与抗ds-DNAds-DNA抗

6、体结合。抗体结合。）DNADNA抗体与抗体与DNADNA的结合能力与的结合能力与DNADNA抗原抗原 分子的碱基组成有关：分子的碱基组成有关：G+CG+C含含量高的量高的 DNADNA分子更易与抗体结合。分子更易与抗体结合。）DNADNA分子中含有某些复杂或特殊的结构时，更易与抗体结合：如含有较分子中含有某些复杂或特殊的结构时，更易与抗体结合：如含有较多的重复序列、多的重复序列、CpGCpG及甲基胞密啶及甲基胞密啶(mC)(mC)。 二Ds-DNADs-DNA分子的免疫原性分子的免疫原性. .用常规的免疫方法，用常规的免疫方法，ds-DNAds-DNA一般一般不能诱导动物产生相应的抗体。不能诱

7、导动物产生相应的抗体。. .来源于原核生物的来源于原核生物的ds-DNAds-DNA比真核生物的比真核生物的 ds-DNAds-DNA更容易通过免疫动物更容易通过免疫动物来制备抗体。来制备抗体。. .在某些特定的情况下，真核细胞的在某些特定的情况下，真核细胞的ds-DNAds-DNA才具有免疫原性。才具有免疫原性。 三三DNADNA的单克隆自身抗体的单克隆自身抗体与常规的单克隆技术相比，自身单克隆抗体的制备更为简便，不需要与常规的单克隆技术相比，自身单克隆抗体的制备更为简便，不需要人工免疫动物，直接将自身免疫病的动物模型的脾细胞或病人的外周血淋人工免疫动物，直接将自身免疫病的动物模型的脾细胞或

8、病人的外周血淋巴细胞与相应的瘤细胞株融合就可建立杂交瘤，采用不同的抗原进行筛选，巴细胞与相应的瘤细胞株融合就可建立杂交瘤，采用不同的抗原进行筛选，则可获得多种单克隆抗体。则可获得多种单克隆抗体。 按融合细胞的来源不同，按融合细胞的来源不同，DNADNA抗体的杂交瘤可分为三类：抗体的杂交瘤可分为三类：1.1.鼠鼠杂交瘤：鼠鼠杂交瘤：将近交的将近交的SLESLE小鼠模型的脾细胞与鼠的骨髓瘤细胞进行小鼠模型的脾细胞与鼠的骨髓瘤细胞进行融合。融合。2.2.人鼠杂交瘤：人鼠杂交瘤：用用SLESLE病人能分泌病人能分泌DNADNA抗体的抗体的B B细胞与鼠的骨髓瘤细胞细胞与鼠的骨髓瘤细胞融合。融合。. .

9、人人杂交瘤：人人杂交瘤：用用SLESLE病人的外周血淋巴病人的外周血淋巴细胞或脾细胞与人的骨髓瘤细胞融合。细胞或脾细胞与人的骨髓瘤细胞融合。 另外将经过另外将经过EBEB病毒转化的病毒转化的SLESLE病人的病人的B B淋巴细胞进行克隆，这种转化的淋巴细胞进行克隆，这种转化的B B细胞亦可细胞亦可分泌抗分泌抗ds-DNAds-DNA。此法更为简便，因为细胞融。此法更为简便，因为细胞融合的步骤也不需要了，但这种合的步骤也不需要了，但这种EBEB病毒转化的病毒转化的B B细胞产生抗体的量比较少。细胞产生抗体的量比较少。人人人人DNADNA杂交瘤及其分泌的抗杂交瘤及其分泌的抗DNADNA抗体研究的意

10、义：抗体研究的意义：1.1.通过分析单克隆抗体的特异性，可以更进一步地了解通过分析单克隆抗体的特异性，可以更进一步地了解DNADNA在在SLESLE中的作中的作用。用。2.2.作为抗原，作为抗原，DNADNA抗体又可诱导抗抗体又可诱导抗DNADNA抗体的独特型抗体。这种抗独特型抗体的独特型抗体。这种抗独特型有助于研究有助于研究SLESLE产生产生DNADNA抗体的调控机制。抗体的调控机制。3.3.这种杂交瘤细胞本身可用于分析与自身抗体的产生有关的基因结构。这种杂交瘤细胞本身可用于分析与自身抗体的产生有关的基因结构。DNADNA的单克隆抗体存在的问题的单克隆抗体存在的问题1.1.代表性的问题：作

11、为一种多抗原决定簇的分子，由其引发的免疫反应包含代表性的问题：作为一种多抗原决定簇的分子，由其引发的免疫反应包含了许许多多针对不同抗原决定簇的多克隆抗体。显然，只针对一个或少数了许许多多针对不同抗原决定簇的多克隆抗体。显然，只针对一个或少数几个决定簇的单克隆抗体，代表不了几个决定簇的单克隆抗体，代表不了DNADNA引起的整个免疫反应。引起的整个免疫反应。2.2.单克隆抗体可能因静电引力与单克隆抗体可能因静电引力与“粘性粘性”分子呈非特异结合。分子呈非特异结合。3.3.由于不同来源的分子之间的相似性以及某些在化学结构和性质上与由于不同来源的分子之间的相似性以及某些在化学结构和性质上与DNADNA

12、相似的化合物的存在，使相似的化合物的存在，使DNADNA单克隆抗体的交叉反应显得尤为突出。单克隆抗体的交叉反应显得尤为突出。 四四DNADNA抗体的交叉反应抗体的交叉反应 几乎所有的几乎所有的DNADNA单克隆和多克隆抗体既能与单克隆和多克隆抗体既能与ds-DNAds-DNA又可与又可与ssssDNADNA反应，而且在多数情况下，反应，而且在多数情况下，DNADNA抗体与抗体与ssssDNADNA的亲和力更高。的亲和力更高。但是单纯针对但是单纯针对ssssDNADNA的抗的抗ssssDNADNA抗体则只能与抗体则只能与ssssDNADNA结合不能与结合不能与ds-DNAds-DNA结合。结合。

13、 DNADNA抗体能结合的分子包括抗体能结合的分子包括Z ZDNADNA、某些人互合成的多核苷酸如、某些人互合成的多核苷酸如poly(I)poly(I)、poly(dT)poly(dT)、poly(dAdT)poly(dAdT)，POLY(dGdC)POLY(dGdC)等。不少多聚阴离子化等。不少多聚阴离子化合物如心磷脂和其它磷脂、硫酸右旋糖酐、透明质酸和硫酸软骨素以及硫合物如心磷脂和其它磷脂、硫酸右旋糖酐、透明质酸和硫酸软骨素以及硫酸肝素等都可与酸肝素等都可与ds-DNAds-DNA抗体结合。抗体结合。 研究和了解抗研究和了解抗DNADNA的交叉反应的临床意义：的交叉反应的临床意义：1.1.

14、解释解释SLESLE病人出现梅毒试验阳性的现象。病人出现梅毒试验阳性的现象。2.2.利用抗利用抗ds-DNAds-DNA抗体与硫酸右旋糖酐（抗体与硫酸右旋糖酐（DSDS）的反应，可将的反应，可将DSDS吸附在硝酸纤维素柱上，吸附在硝酸纤维素柱上，用来去除用来去除SLESLE病人血中的抗病人血中的抗ds-DNAds-DNA抗体。抗体。3.3.对抗对抗ds-DNAds-DNA抗体和抗体和ds-DNAds-DNA在在SLESLE的发病机制中的重新评价。的发病机制中的重新评价。传统的观点：传统的观点：免疫复合物沉积学说。免疫复合物沉积学说。新的观点：新的观点：DNADNA抗体可能通过与肾小球某些成分上

15、的抗原的交叉反应，或抗体可能通过与肾小球某些成分上的抗原的交叉反应，或者通过电荷的作用，直接结合在肾小球基底膜上，产生阻塞或导致补体介者通过电荷的作用，直接结合在肾小球基底膜上，产生阻塞或导致补体介导的炎症和组织损害。导的炎症和组织损害。 五DS-DNA抗体的独特型独特型独特型(Idiotype,Id) (Idiotype,Id) ：通常是指位于抗体可变区的抗原决定簇。通常是指位于抗体可变区的抗原决定簇。私有私有Id(private Id)Id(private Id)：只存在于某一种类型抗体中的只存在于某一种类型抗体中的Id Id 。公共公共Id(public Id)Id(public Id)

16、：几种或多种抗体共同拥有的几种或多种抗体共同拥有的IdId。 16/616/6公共公共IdId：在活动性的在活动性的SLESLE中，有一半以上的病人血清中的中，有一半以上的病人血清中的DNADNA抗体带有的一种公共抗体带有的一种公共IdId。16/6Id16/6Id与与SLESLE的活动性有关，病情活动时，的活动性有关，病情活动时，16/6Id16/6Id的滴度上升，反之的滴度上升，反之则下降，则下降，SLESLE病人受损的组织中亦显示有病人受损的组织中亦显示有16/616/6的沉积。的沉积。研究研究16/6Id16/6Id的重要意义是：的重要意义是：16/6Id16/6Id可以诱导正常的小鼠

17、发展成可以诱导正常的小鼠发展成SLESLE。因。因此此SLESLE极有可能是一种由极有可能是一种由IdId诱导的疾病。诱导的疾病。两种假设：两种假设：1.6/6Id1.6/6Id（Ab1Ab1）免疫小鼠，刺激产生了抗）免疫小鼠，刺激产生了抗16/6Id16/6Id（Ab2Ab2），），Ab2Ab2又可刺又可刺激小鼠产生抗抗激小鼠产生抗抗16/6Id16/6Id（Ab3Ab3）。）。Ab3Ab3则带有原来的病理性则带有原来的病理性16/6Id16/6Id，这种抗体可能就是抗，这种抗体可能就是抗DNADNA抗体，抗体，后者可导致后者可导致SLESLE的发生。的发生。2.2.针对针对16/6Id16

18、/6Id的抗的抗16/6Id16/6Id与自身抗原（与自身抗原（DNADNA）相似。因此，这种抗）相似。因此，这种抗16/6Id 16/6Id 的产生又使小鼠产生抗抗的产生又使小鼠产生抗抗6/6Id6/6Id，后者可与，后者可与DNADNA反应。反应。 六抗六抗ds-DNAds-DNA的检测的检测1.1.免疫萤光法（免疫萤光法（IFTIFT）2.2.放射免疫法（放射免疫法（RIARIA）3.ELISA3.ELISA4.4.斑点免疫金渗滤法（斑点免疫金渗滤法（DIGFADIGFA） 5.5.生物芯片法生物芯片法优点：优点：1.1.目前仍为检测抗目前仍为检测抗dsdsDNADNA抗体的金标准。抗体

19、的金标准。2.2.特异性高特异性高3.3.可同时检测可同时检测ANAANA和抗和抗dsdsDNADNA抗体。抗体。4.4.可半定量检测抗可半定量检测抗dsdsDNADNA抗体（滴度）。抗体（滴度）。缺点：缺点：1.1.敏感性不高。敏感性不高。2.2.短膜虫的培养和传代比较费时费事。短膜虫的培养和传代比较费时费事。3.3.操作方法也比较烦琐、不易标准化。操作方法也比较烦琐、不易标准化。4.4.近几年也有假阳性报道。近几年也有假阳性报道。优点：优点：1.1.敏感性较高。敏感性较高。2.2.可以定量测定可以定量测定dsdsDNADNA抗体。抗体。缺点：缺点：1.1.假阳性率较高。假阳性率较高。2.2

20、.有放射性污染。有放射性污染。优点：优点：1.1.方法比较稳定，应用广泛。方法比较稳定，应用广泛。2.2.可以定量，但多数情况下只是定性测定。可以定量，但多数情况下只是定性测定。缺点：缺点：1.1.试剂盒大多为进口产品，价格较高。试剂盒大多为进口产品，价格较高。2.2.操作步骤较多，比较费时。操作步骤较多，比较费时。优点：优点：1.1.快速、简便，只需快速、简便，只需2 2分钟，分钟，2 2个步骤。个步骤。2.2.敏感性与敏感性与ELISAELISA相当，特异性与免疫荧光法相近。相当，特异性与免疫荧光法相近。缺点：缺点： 不能定量。不能定量。优点：优点：1.1.高通量，可同时检测多份标本，多种

21、自身抗体。高通量，可同时检测多份标本，多种自身抗体。2.2.可定量测定。可定量测定。缺点：缺点： 成本较高，可通过灵活多样的组合降低成本。成本较高，可通过灵活多样的组合降低成本。 流式荧光检测仪流式荧光检测仪Luminex 100Luminex 100多功能流式点阵仪多功能流式点阵仪流式荧光检测仪流式荧光检测仪流式荧光技术流式荧光技术 流式荧光技术流式荧光技术激光激发荧光的发光类技术之激光激发荧光的发光类技术之一一 ( (Bead Based) Suspension ArrayBead Based) Suspension Array （基于微珠的）悬浮阵列（基于微珠的）悬浮阵列 LiquidC

22、hipLiquidChip（QIAGEN QIAGEN ） 液态芯片、液体芯片、液相芯片液态芯片、液体芯片、液相芯片 Flexible Multi-Analyte Profiling systemFlexible Multi-Analyte Profiling system xMAPxMAP 多功能多指标并行分析系统多功能多指标并行分析系统 Bead/Microsphere ArrayBead/Microsphere Array 微珠阵列微珠阵列荧光编码微球技术共价交联技术CONH蛋白、核酸反应模式核酸抗原抗体AFPCEANSECA125CA242F-PSAT-PSACYFRA21-1Free

23、 -hCG检测模式检测模式通过类似流式细胞技术，逐通过类似流式细胞技术，逐颗分析颗分析红色激光红色激光635nm635nm，识别不同编，识别不同编码的微球码的微球绿色激光绿色激光532nm532nm，用于检测检，用于检测检测信号测信号检测流程检测流程固相反应模式固相反应模式流式荧光反应模式流式荧光反应模式AFPCEANSECA125CA242F-PSAT-PSACYFRA21-1Free -hCG微量微量标本，标本，1 1次检测，次检测，100100个指标个指标 七抗七抗ds-DNAds-DNA在在SLESLE诊断和治疗监诊断和治疗监测中的作用测中的作用1.1.抗抗ds-DNAds-DNA是公

24、论的是公论的SLESLE的标志抗体，的标志抗体，19821982年国际风湿病协会把抗年国际风湿病协会把抗ds-ds-DNADNA阳性列为阳性列为SLESLE的诊断标准之一。的诊断标准之一。2.2.抗抗ds-DNAds-DNA在活动性在活动性SLESLE的病人中阳性率高（可达以上）。的病人中阳性率高（可达以上）。3.3.抗抗ds-DNAds-DNA可以作为监测可以作为监测SLESLE病情的指标。病情的指标。4.4.带有带有16/6Id16/6Id的抗的抗ds-DNAds-DNA可以传递可以传递SLESLE。5.5.去除血液中的抗去除血液中的抗ds-DNAds-DNA可以使可以使SLESLE的症状得到缓解。的症状得到缓解。DNADNA自身抗体的研究进展自身抗体的研究进展南京军区福州总医院南京军区福州总医院全军检验中心全军检验中心兰兰 小小 鹏鹏 三三DNADNA的单克隆自身抗体的单克隆自身抗体与常规的单克隆技