细胞凋亡、细胞周期

1、研究细胞生命活动的流研究细胞生命活动的流式解决方案式解决方案 techuniv丁 玮玮细胞凋亡概述细胞凋亡概述又称为程序性细胞死亡又称为程序性细胞死亡 (Programmed Cell Death) 是机体是机体主动的、高主动的、高度有序度有序地清除无用细胞的过程。和地清除无用细胞的过程。和细胞坏死细胞坏死 (Necrosis) 相区别，坏死相区别，坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。薄膜有小泡状形成薄膜有小泡状形成细胞凋亡与疾病的关系细胞凋亡与疾病的关系3细胞凋亡事件发生表细胞凋亡

2、事件发生表细胞膜事件线粒体事件Caspase事件细胞核事件1. 细胞膜变化的检测：细胞膜变化的检测：Annexin V/PI磷脂酰丝氨酸磷脂酰丝氨酸 (PS) 的检测：早期凋亡的检测：早期凋亡早期凋亡早期凋亡PS检测及结果判定检测及结果判定早期凋亡特征：早期凋亡特征：磷脂膜(PS)外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性DNA没有发生断裂早期凋亡早期凋亡PS检测及结果判定检测及结果判定Annexin V-FITCPI细胞膜变化的检测：细胞膜变化的检测：Annexin V/PI优点：优点：简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞样本设置：样本设置：1. 空白对照：空白对照：辅助判断管

3、，即不加Annexin V/PI，但用它调电压的话，电压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。2. 单阳样本：单阳样本：诱导凋亡，Annexin V单染，用来调补偿3. 单阳样本：单阳样本：诱导凋亡，PI单染，用来调补偿注意事项：注意事项：1. 细胞制备或储存时细胞膜损伤，造成假阳性2. 贴壁细胞消化时避免使用EDTA，螯合钙离子BD Annexin V 流式检测试剂盒流式检测试剂盒KitCat no.Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit I556547Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit II-Contains

4、 unlabeled recomb. Annexin V556570Annexin V:PE Apoptosis Detection Kit I559763提供FITC, PE, APC,CY5,CY5.5, BD Horizon V450, BD Horizon V500等多种荧光标记的Annexin V以及纯净的Annexin V。Annexin V检测常见问题检测常见问题1. 是否 Annexin V Kits 可以检测小鼠或其他物种? Annexin V试剂盒可以检测多种属2. 这个试剂盒是否可用于贴壁细胞、固定或冻存的细胞、或组织? No. 上述样本的细胞细胞膜都会或多或少受到损害，

5、这样的样本建议用免疫荧光技术 (Cat. No. 550911) 3. 是否与细胞表面标记兼容? CD11B/MAC-1 LY-71 只要Ca离子不影响该表面Marker就可以同时做2. 线粒体水平的检测线粒体水平的检测激活Caspase 9激活Caspase 3启动细胞凋亡 凋亡与线粒体膜电位的去极化相关 BD Mitoscreen (JC-1) Cat# 551302 25 tests JC-1: 可穿透细胞膜的亲脂性阳离子荧光素 原理：原理： JC-1在正常细胞中以聚合体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光（FL-2 Channel）； 细胞凋亡时，线粒体膜电位发生去极化，膜电位降低，JC

6、-1 以单体形式存在于胞浆内，荧光 强度减弱甚至消失 （只能在FL1通道检测到），故用荧光信号的变化判别凋亡的发生。p 操作简单，试剂直接加入细胞中，操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测分钟后检测2. 线粒体水平的检测线粒体水平的检测JC-1检测结果流式图检测结果流式图JC-1 (Fl-1)Jurkat T CellsMouse ThymocytesControl StaurosporineCamptothecinFas mAbR1R2R1R2R1R2R1R2R1R2R1R2Control JC-1 (Fl-2)3. 凋亡相关酶的检测凋亡相关酶的检测- Caspase 背景知识背景知识

7、 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶） Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即Caspase 3激活=细胞凋亡 检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的Caspase活性。Jurkat T-Cells 6 M camptothecin for 4 h untreated Caspase-3 data（IHC） Caspase-3 data（FCM） Jurkat T-Cells Mouse ThymocytesFITC Active Caspase-3 Apoptosis KitCat No.FITC

8、 Active Caspase-3 Apoptosis Kit550480PE Active Caspase-3 Apoptosis Kit550914Caspase-3 Kits4. 细胞核细胞核DNA检测检测 凋亡晚期DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段。检测方法Tunel流式法:通过在核酸片段末端标记计算凋亡百分比末端转移酶标记技术细胞核细胞核DNA检测原理：检测原理：APO-BrdUTdT: 脱氧核糖核苷酸末端转移酶Brd UTP的渗入率显著高于dUTP，因此检测灵敏度高TUNEL法法: 流式分析晚期凋亡流式分析晚期凋亡APO-DIREC

9、T KIT 50 tests cat. 556381Part A (store at 4) Part B (store at 20)PI/Rnase staining buffer FITC-dUTPReaction buffer Negative control cellsRising buffer Positive control cellsWash buffer TdT Enzyme实验用2种染料PI染色总DNA：得到细胞周期的信息；FITC-dUTP染色凋亡细胞：检测凋亡。在流式细胞仪488nm激发下，PI发射约623nm荧光，FITC发射520nm荧光。 APO-BrdU KIT 6

10、0 tests cat. 556405Part A (store at 4) Part B (store at 20)FITC-Labeled Anti-BrdU mAb Br-dUTPPI/Rnase staining bufferReaction buffer Negative control cellsRising buffer Positive control cellsWash buffer TdT EnzymePI染色检测细胞周期FITC染色检测凋亡（如果不需要周期信息，则可不做PI染色步骤） TUNEL法法: 流式分析晚期凋亡流式分析晚期凋亡21BD流式系列课堂流式系列课堂-1：研究细胞生命活动的流研究细胞生命活动的流式解决方案式解决方案 DNA含量与细胞周期含量与细胞周期检测原理检测原理利用特殊的荧光染料(PI等)与细胞内DNA碱基结合，被这些荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量。PI染色细胞周期样本检测细胞周期样本检测结果分析结果分析CellQuest、WinMDI等软件均可以进行分析，但需要手工进行参数统计和计算；推荐使用ModFit分析软件（分析如下：）1. 打开软件；2. 在FL2-W/FL2-A散点图中设定单个细胞门（R1），去除聚集细胞，必要