微生物工程总复习整理

1、微生物工程总复习名词解释:简答题：论述题：15题7题2题共45分共35分共20分第一章概论微生物工程：将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。又称为发酵工程，是生物技术的重要组成部分，是生物技术产业化的重要环节。简述微生物工程发展简史(四个阶段特征)1、天然发酵2-纯培养技术一一第一代发酵技术3-深层培养技术一一第二代发酵技术4-微生物工程一一第三代发酵技术简述微生物工程组成及研究内容1、微生物工程组成从广义上讲，由三部分组成：上游工程发酵工程下游工程2、微生物工程研究内容(1)无菌生长技术；(2)计算机控制技术；

2、(3)种子培养和生产培养工艺技术;(4)小试中试动力学模型；(5)发酵工程工艺放大。第二章生产菌种的来源试述生产菌种的来源及其分离思路来源：根据资料直接向科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。分离思路：依照生产要求、产物性质、菌种特性(分类地位及生态环境)，设计各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染杂菌，也必须重新进行分离纯化。筛选重点：抗生素及治疗作用的药物产生菌。试述生物物质产生菌的分离纯化和筛选步骤(1)定方案查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。(2)标本采集有针对性地采集样品。(3)增殖：人为地通过

3、控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。(4)分离：利用分离技术得到纯种。(5)性能鉴定发酵性能测定进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。第三章微生物代谢调节及代谢工程新陈代谢(分解代谢、合成代谢)：新陈代谢(metabolism)是指发生在活细胞中的各种分解代谢(catabolism)和合成代谢(anabolism)的总和。即：新陈代谢=分解代谢+合成代谢分解代谢：指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，产生简单分子、腺昔三磷酸(ATP形式的能量和还原力(或称

4、还原当量，一般用H来表示)的作用。合成代谢：与分解代谢正好相反，是指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、ATP形式的能量和H形式的还原力一起合成复杂大分子的过程。分解代谢与合成代谢的含义及其间的关系可简单地表示为：幅活性调节：酶分子水平上的一种代谢调节，通过改变酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括：酶活性的激活和抑制两个方面。能荷：细胞ATP、ADPAM时作为代谢反应功能的高能磷酸键的量度，通过ATP、ADPAMPE者的比例调节代谢。协同反馈抑制：指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式合作反馈抑制：两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物

5、大得多的反馈抑制作用。累积反馈抑制：每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用发生累积。顺序反馈抑制：当E过多时，抑制C-D,由于C浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果造成G浓度的增高。由于G过多抑制了C-F,结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对A-B间的酶发生抑制，从而达到反馈抑制的效果。通过逐步有顺序的方式达到的调节称为顺序反馈抑制。试述幅活性调节、合成调节的异同点酶分子水平上的一种代谢调节，通过改变酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括：酶活性的激活和抑制两个方面。酶活性激活系指在分解代谢途径中，后面的反应可被较前面的中

6、间产物所促进。酶活性的抑制主要是反馈抑制，它主要表现在某代谢途径的末端产物(即终产物)过量时，这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免末端产物过多累积。通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，是一种在基因水平上(在原核生物中主要在转录水平上)的代谢调节。与上述调节酶活性的反馈抑制等相比，调节酶的合成(即产酶量)而实现代谢调节方式是一类较间接而缓慢的调节方式。在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节两者同时存在密切配合、协调进行。第四章优良菌种选育原生质体融合技术：原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。

7、原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。原生质体融合作为一种新的基因重组手段，在动植物细胞融合的基础上发展起来，从而打破种属的问的界限，提高重组频率，扩大重组幅度。诱变剂：能提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。试述优良菌种应具备的条件1、产生大量发酵产物，投资减少，生产能力提高；2、副产物及其他产物不产生或少产生，转化率提高，分离纯化难度、成本降低，品质提高；3、生长繁殖快，生长速率强，缩短发酵周期，设备投资运转费用减少，减少菌种退化及污染几率；4、高效转化产品，降低成本，竞争力提高5、能利用廉价原料，对原料成分敏感性小；6、对添加的前提物质有耐受力；7、泡沫少，提高装料系数、提高单罐产量及

8、降低成本8、具有抗噬菌体感染的能力；9、遗传特性稳定。试述基因工程技术育种步骤(1)获得待克隆的DNA片段(基因)；(2)目的基因与载体在体外连接；(3)重组DNA分子导入宿主细胞；(4)筛选、鉴定阳性重组子；(5)重组子的扩增与表达。何为醉母载体？可携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA。有哪些类型？A、Yep类(Yeastepisomalplasmid)一酵母附加体质粒复制序列为酵母2仙序列，长度6.3kb,自我复制特点：较稳定，5-50拷贝数；10-10个/igDNAB、YRp类(YeastReplicationplasmid)一酵母复制质粒复制序

9、列为非2n序列，是自主复制序列(AutoReplicationSequence,ARS。特性：稳定性差，拷贝数5-10,转化频率10-10个/gDNAC、YCp类(YeastCentromericplasmid)一酵母中心粒质粒复制序列为ARS,含有酵母染色体中心粒、端粒成分特性：参与有丝分裂及减数分裂，精确分配；稳定性好，但拷贝数只有一个，转化频率10-104/gDNAD>YIp(YeastIntegrativeplasmid)一酵母整合型质粒含有可与酵母染色体重组的序列，可以完全整合到染色体中，因此它依靠酵母染色体进行复制。特性：稳定性很好；拷贝数只一个；转化频率1-100/gDNA

10、质粒不稳定产生的原因有哪些？如何提高稳定性？分裂不稳定：工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变A、选择合适的宿主菌一一比生长速率、重组系统的特性、外源基因与染色体序列同源B、合适的载体一一拷贝数C、选择压力一一抗生素的量D分阶段培养控制两阶段培养法：第一阶段使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。在培养基中加入选择性压力如抗生素等，以抑制质粒丢失菌的生长。温度、pH、培E、通过控制环境参数和溶解氧浓度，调节比生长速率，使工程菌生长具有优势。有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而间歇改变培养条

11、件以改变这两种菌的比生长速率，可以改善质粒的稳定性。第五章菌种保藏原理和方法冷冻干燥保法：在减压条件下使冻结细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。长期保藏最为有效的方法之一。液氮冷冻法：菌种以甘油等作为保护剂，在液氮超低温下保存的方法。第六章培养基种子培养基培养种子的目的：扩大培养，增加细胞数量；同时也必须培养出强壮、健康、活性高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长。特点：必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。各种营养物质的浓度不必太高。供抱子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。成分与发酵培养基的主要成分相近。发酵培养基发酵生产最主要的培养基

12、，耗用大量的原材料，决定发酵生产成功与否的重要因素。(1)根据产物合成的特点来设计培养基对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。对于生产氨基酸等含氮化合物时，发酵培养基除供给充足的碳素，还应添加足够的钱盐或尿素等氮素。(2)各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。(3)发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、质量以及价格等必须予以重视。第七章发醉工艺控制补料分批培养只有料液的加入没有料液的取出，发酵结束时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足

13、而导致的发酵过早结束的缺点。连续培养一边补入新鲜料液一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定。达到稳态后，整个过程中菌的浓度，产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的。比耗氧速度或呼吸强度(Q)单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气。摄氧率(r)单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。溶解氧浓度(CL)单位体积发酵液所含的氧气量临界溶氧浓度(CCr)指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。温度对发醉的影响体现在哪些方面？1、对微生物生长的影响2、温度影响反应速率3、温度影响呼吸强度、生长速率及产率4;温度影响发酵方向发醉过程pH变化的原因有哪些？如何确定最

14、佳pH?(D基质代谢代谢糖快速利用，分解成小分子酸、醇，使pH下降；糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。氮代谢当氨基酸中的-NH被利用后pH会下降；尿素被分解成NH,pH上升，NH利用后pH下降，当碳源不足时，氮源当碳源利用，pH上升；生理酸、碱性物质，利用后pH会上升或下降。(2)产物形成某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。(3)菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升(4)发酵液中pH下降的因素C/N比例不当(过高)；消泡油加得过多；生理酸性物质的存在，氨被利用。(5)发酵液中pH上升的因素C/N比例不当(

15、过低)；生理碱性物质存在；中间补料加入的氨水或尿素过多。最佳PH的确定：配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况，通过数据绘图得出结论。试述影响供氧的因素根据气液传递速率方程式：OTR=K(C*-CL)可知，推动力、比表面积及传递系数影响供氧；此外，发酵罐液体体积、高度、理化性状也会影响供氧。(1)影响Ka的因素搅拌空气流量培养液性质微生物生长消泡剂离子强度氧载体(2)影响推动力的因素提供推动力可增加氧的饱和度；溶解度随温度的升高而下降；在电解质溶液中，因盐析作用而降低；随溶质浓度的增大而下降；有机溶液中，比水中高。发酵过程中溶氧浓度监控有何意义？1 .察工艺控制是否满足要求；2 .其它异常

16、情况的表征；如染菌、噬菌体、设备和操作故障。3 .间接控制的措施；何为泡沫？产生的原因及危害是什么？泡沫的定义：一般来说：泡沫是气体在液体中的粗分散体，属于气液非均相体系。美国道康宁公司对泡沫定义：体积密度接近气体，而不接近液体的“气/液”分散体。泡沫形成的原因(1)气液接触泡沫是气体在液体中的粗分散体，产生泡沫的首要条件是气体和液体发生接触。而且只有气体与液体连续、充分地接触才会产生过量的泡沫。气体从液体内部产生时，形成的泡沫一般气泡较小、较稳定。(2)含助泡剂未加助泡剂，并不纯净的水中产生的泡沫，其寿命在0.5秒之内，只能瞬间存在。摇荡纯溶剂不起泡，如蒸储水，只有摇荡某种溶液才会起泡。(3

17、)起泡速度高于破泡速度起泡的难易，取决于液体的成分及所经受的条件；即气泡和泡破灭后形成的液滴在表面自由能上的差别；同时还取决于泡沫破裂速度等因素。起泡的危害(1)降低生产能力在发酵罐中为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量。(2)引起原料浪费如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。(3)影响菌的呼吸如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。(4)引起染菌泡沫增多而引起逃液，在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会进入发酵罐而造成染菌。第八章参数检测和自动控制物理参数及化学参数检测的指标有哪

18、些？物理参数检测：温度、生物热、搅拌速度、搅拌功率、通气量、罐压、发酵液粘度等化学参数检测：pHDOCO细胞浓度、基质浓度、产物浓度等。发酵工业用的传感器应满足的要求是什么？1、传感器能经受高压蒸汽灭菌；2、传感器及其二次仪表具有长期稳定性；3、最好能在过程中随时校正；4、探头材料不易老化，使用寿命长；5、探头安装使用和维修方便；6、解决探头敏感部位被物料(反应液)粘住、堵塞问题；7、价格合理，便于推广应用。第九章微生物反应动力学生长速率：单位体积单位时间内菌体细胞生长量比生长速率：菌体细胞的瞬时生长速率稀释度(D):流量与培养液体积之比，称为稀释度。临界稀释率(Dc):稳态下的比生长速率可通

19、过改变培养基的流加速度加以改变，但是，稀释率的大小有一定的限制，即为临界稀释率。发醉类型1、第I型生长与产物合成偶联型，生长相关型。特点：(D微生物的生长和糖的利用与产物合成直接相关联；(2)产物形成与生长同步；(3)产物合成速度与微生物生长速度呈线性关系，且生长与营养物的消耗成准定量关系。2、第II型生长与产物合成部分相关型。特点：(1)第一时期，细胞迅速生长，产物的生成很少或全无；(2)第二时期，产物高速形成，生长可能出现第二个高峰，碳源利用很高。3、第m型生长与产物合成非偶联类型，生长不相关型。特点：(1)产物生成与细胞生长无直接联系，产物合成与碳源利用无准量关系；(2)细胞处于生长阶段

20、时，无产物积累，细胞停止生长后，产物大量生成。何为Monod方程？有何意义？Mono昉程：描述菌体生长比速(小)与限制性基质(S)关系方程意义：此式可反映某一微生物在限制性基质浓度变化时的比生长速率的变化规律。试述连续发酵的优点及存在的问题连续发酵优点(1)有利于缩短发酵周期，提高劳动生产率；减少清洗、投料、消毒时间，缩短发酵周期和提高设备利用率。细胞生长处于最高生长繁殖状态，明显提高生产效率，特别是对生产周期短的产品，效果更为显著。(2)生产过程比较稳定、均衡，各项参数也较恒定，便于自动化控制，产品质量稳定；(3)采用管道化和自动化生产，明显降低劳动强度。连续发酵存在的问题(1)菌种易于退化

21、；(2)易遭杂菌污染；对发酵设备和空气净化系统的无菌要求更高。所谓“连续”有时间限制，一般可达数月至1、2年。(3)对于某些原材料价格昂贵的产品，由于连续发酵对基质利用率较低，往往造成生产成本的增加。第十章杂菌的防治染菌危害，对提炼有什么影响？1 .含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质；2 .采用有机溶剂萃取的提炼工艺，易乳化，很难使水相和溶剂相分离；3 .采用离子交换树脂提取工艺，杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，降低交换容量，而有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯；发酵终点判断的依据是什么？(1)比生产率随着发酵的进行比生产率由上升到平

22、缓，最后下降，生产率下降明显表示菌体衰老，应结束发酵。(2)产物浓度要求在产物最高时结束。(3)氨基氮和pH发酵后期由于菌体自溶，氨基氮和pH上升。所以综合地看，可从：产物、基质、菌体、pH来判断一个发酵过程是否应该结束。第H一章下游概论下游加工工程的一般程序1、预处理和固液分离：加速固液相分离2、细胞破碎分离胞内产物3、初步纯化（提取）除去与目的产物性质差异很大的杂质。4、高度纯化（精致）除去与产物性质相似的杂质。5、产品加工第十二章产物的纯化比阻值：衡量过滤特性的指标是滤饼的质量比阻r,表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼结构特征有关。CohL方程:描述蛋白质的溶解度与盐浓度之间的关系。单级

23、萃取:只包括一个混合器和一个分离器的萃取流程。和多级萃取（错流和逆流）多级错流萃取萃取后的萃余液与新鲜的萃取剂混合，再进行下一次萃取，第一级的萃余液作为第二级的料液，与新鲜的萃取剂混合，第二级的萃余液再作为第三级的料液。多级逆流萃取第一级加入料液，逐级向下级移动，从最后一级排出；萃取剂从最后一级进入，逐级向上级移动，从第一级排出。料液移动的方向与萃取剂移动的方向相反，称为多级逆流萃取本目图：两水相形成的条件和定量关系可用相图来表示，对于由两种聚合物和水组成的系统。临界点：系线向下移动，长度逐渐减小，两相差别减小，当达到C点时，系线长度为零，两相间差别消失，点C称为临界点。双节线：曲线把均匀区域

24、和两相区域分隔开来，称为双节线。系线：MT、B三点在一直线上，T和B代表成平衡的两相，其相连直线称为系线。交联度：合成树脂时单体中交联剂（如二乙烯苯）的含量百分数称为交联度。表征高分子链的交联程度。孚L化：一种液体分散到另一种本不相溶液体的现象。去乳化：去除可溶性杂蛋白的方法蛋白质等电点沉淀酸性溶液中与阴离子物质结合形成沉淀碱性溶液中与阳离子形成沉淀盐析热变性加入絮凝剂有机溶剂沉淀原理及优缺点(1)原理有机溶剂能降低水溶液的介电常数，介电常数减少，静电吸引力增大，溶质分子异性电荷库仑引力的增加而使离子之间不断接近，带电基团距离随之减少，溶质相互吸引凝聚。有机溶剂能使分子表面水层厚度减少，脱水而

25、凝聚析出。(2)优缺点1)分辨能力比盐析法高，有机溶剂浓度窄的范围内沉淀不用脱盐；2)有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，固液分离容易；3)易蒸发，无残留，适于食品、药品制备；4)易引起蛋白质变性失活，操作需低温；5)有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。简述萃取原理利用物质在两种成相溶剂中溶解度的不同，目标物质从一种溶剂中转移到另一种溶剂中，从而达到分离纯化的目的。以分配定律为基础。何为亲水亲油平衡值(HLB,有何意义？根据表面活性剂的亲水亲油平衡值(HydrophilicLipophilicbalance,HLB)选择，表示亲水与亲脂的相对强弱。HLB数越大，亲水性越强，形成O/W型；HLB数越

26、小，亲脂性越强，形成W/O型；常用的去乳化剂有哪些？有何危害？澳代十六烷基口比咤：阳离子表面活性剂，用于W/O型乳浊液的破乳化；十二烷基磺酸钠(SD9：阴离子表面活性剂，微溶于有机溶剂，用于W/O型乳浊液的破乳化；双水相萃取影响因素生物物质在双水相中的分配系数主要由电化学位、疏水作用、生物亲和力、粒子大小和蛋白质的构象效应所决定，这些因素分为环境因素和结构因素两方面环境因素：成相高聚物的种类与浓度、高聚物的亲和基团、盐的种类和浓度、成相采用的重力以及温度等；结构因素：亲水性的大小和电荷的影响。(1)成相高聚物浓度(2)成相高聚物分子量(3)盐(4)pH(5)溶质分子(6)温度离子交换树脂的分类

27、1 .强酸性阳离子交换树脂2 .弱酸性阳离子交换树脂3 .强碱性阴离子交换树脂4 .弱碱性阴离子交换树脂膜分离技术的优点(1)适用范围广；(2)物理过程，不需加入化学药剂、品质稳定性好；(3)分离装置简单，占地面积小，系统集成容易；(4)过程系统简单、操作容易，连续化操作，便于维修，有利于生产自动化的推广与普及;(1) 灵活性强，环保，无污染，投资少；(6)低能耗。第十三章培养基灭菌及灭菌设备热阻：温度超过微生物最适生长温度的上限时，细胞中的蛋白会发生不可逆的凝固变性，引起微生物死亡。实罐灭菌：将配制好的培养基放在发酵罐中，通入蒸气将培养基和设备一起进行灭菌的过程。也叫间歇灭菌、分批灭菌影响培

28、养基灭菌的因素(1)培养基成分油脂糖类蛋白：增加微生物耐热性；高浓度盐类色素：削弱微生物耐热性；浓度较高，相对需要较高温度和较长时间灭菌。pHpH6-8时，微生物最不易死亡；pH<6,氢离子易渗入细胞；pH越低，灭菌时间越短。(3)泡沫泡沫形成隔热层，对灭菌极为不利。(4)颗粒物质颗粒>1mm,需过滤除去；颗粒物质大，火菌困难，反之，火菌容易。颗粒对培养基火菌影响不大。第十四章发醉设备好氧发醉罐的分类按照发酵罐设备特点分(1)机械搅拌通风发酵罐包括循环式，如伍式发酵罐、文氏管发酵罐以及非循环式的通风式发酵罐和自吸式发酵罐等。(2)非机械搅拌通风发酵罐包括循环式的气提式、液提式发酵罐

29、以及非循环式的排管式和喷射式发酵罐。3、按照能量输入方式分(1)内部机械搅拌伍式发酵罐、自吸式发酵罐。(2)外部液体搅拌依靠液体的高速流动，吸入空气，气液混合。(3)空气喷射提升式，压缩空气使气液混合。发醉罐的基本要求(1)适宜的径高比。罐身越高，氧的利用率较高；(2)能承受一定的压力；(3)要保证发酵液必需的溶解氧；(4)应具有足够的冷却面积；(5)减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底，避免染菌；(6)轴封应严密，防病量减少泄漏。十五章空气除菌设备过滤效率：介质层滤去的微粒数与空气中原有的微粒数之比。惯性冲击滞留作用微生物、颗粒由于具有一定的质量，运动时具有惯性，碰到纤维时，由于惯性作用而离开

30、气流碰在纤维表面上，由于摩擦、粘附作用而被滞留在纤维表面上一一惯性冲击滞留作用。当气流速度达到一定时，惯性冲击滞留作用是介质过滤除菌的主要作用。影响介质过滤效率因素(1)介质种类不同过滤介质过滤效率不同。(2)纤维直径在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高。介质滤层厚度(4)介质填充密度(5)空气速度空气流速很低时，过滤效率随气流速度增加而降低；气流速度大于临界值时，过滤效率随气流速度增加而增加。第十六章典型培养过程常用的宿主菌有哪些？大肠杆菌、G细菌、低等真核细胞、哺乳动物细胞何为高密度发酵，高密度培养的措施有哪些？指培养液中工程菌浓度在50DCW/L以上时的发酵状态。单个菌体表达

31、水平基本不变，通过单位体积菌体数量的成倍增加实现总表达量的提高。即高密度发酵。分批补料培养具有连续培养的优点，消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，有效控制了菌体的生长过程。因此，要实现重组大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养法。现在常用的是反馈补料培养。有几种反馈控制：控制基质浓度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生长速率的葡萄糖流加乙酸的产生及控制措施葡萄糖加入量超过菌体生长和二氧化碳产生所需要量或在缺氧的条件下便会产生大量的乙酸，高密度发酵过程中，问题严重。2、减少乙酸积累的对策(1)培养基碳源的含量影响最大。用甘油取代葡萄糖可以降低

32、乙酸的生成，加入某些氨基酸(甘氨酸、甲硫氨酸)减轻了乙酸的抑制作用，提高了重组菌的生长速率和重组蛋白的产率。(2)降低比生长速率生长速率超过某个临界值便产生乙酸。较低的比生长速率虽然产酸少，但同时对产物表达不利，因此选取合适的比生长速率才能达到高密度、高表达发酵。(3)降低培养温度将温度从37c降低到26-30C可以降低菌体对营养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。(4)限制性流加葡萄糖利用葡萄糖为碳源培养重组大肠杆菌时要控制其浓度在较低的范围内，减少乙酸生成。(5)透析培养重组菌的培养过程中可以利用透析技术除去发酵液有害物质，降低乙酸含量可实现重组菌高密度发酵。Lee等用中空纤维膜过滤装置除去