CML患者外周血TCRVδ亚家族T细胞的谱系变化研究

1、CML患者外周血TCR V亚家族T细胞的谱系变化研究 杨毅1*，张翼婷2*，李志雄 1*，陈少华3，杨力建3，李扬秋3（1：临床医学系2005级；2：临床医学系2006级；3：血液病研究所；暨南大学医学院，广东 广州 510632）摘要: 目的 了解慢性粒细胞白血病（CML）病人慢性期（CP）和缓解期（CR）外周血T细胞受体（TCR）V亚家族T细胞的分布和克隆性情况；方法 利用RT-PCR扩增8例CML-CP）和8例 CML-CR 病人外周血T细胞中8个V亚家族基因的互补决定区(CDR3)，了解TCR V亚家族T细胞的分布和利用情况；阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度，从而了解其克隆性。

2、10例健康人外周血作为对照。 结果 8例CML-CP病人外周血T细胞平均表达（3.25±0.89）个 V亚家族，主要以V1、V2和V3的表达为主，而8例CR期病人则平均表达（3.5±0.76）个V亚家族，主要集中在V1、V2、V3和V8中表达；两组与健康对照组（3.5±0.52）比较无统计学意义。此外，V8表达频率在CML-CR病人（5/8）中略高于健康人（3/10）和CML-CP病人（2/8）。基因扫描绝大多数病人和健康人外周血TCR V亚家族T细胞均存在克隆性增殖现象，主要以V1-V3为主，但在CML-CR病人中，表达V7亚家族的两例样本均呈克隆性增殖，这在1

3、0例健康人中均未检测到。结论 三组样本的外周血T细胞中TCR V谱系和克隆性增殖类似，提示CML患者T细胞免疫抑制可能并不主要累及TCR V谱系变化，而在CML-CR期所出现的一些不同的V表达和克隆模式，有待进一步研究。关键词 CML；TCR V基因；基因扫描；克隆性中图分类号 R733.72，R392.11 文献标识码 A 作者简介：杨毅（1986-），男，本科生. 电话E-mail：lufiyy通讯作者：陈少华，电话：（020）85220262，E-mail:jnshaohuachen基金项目: 国家自然科学基金专项基金项目（30424003）、广东省医学科研基金

4、（A2008341）和暨南大学第四批本科生科技创新工程项目（cx08092）资助收稿日期：2008-9-*：共同作者Change of Pattern of TCR V Repertoire in Peripheral Blood from patients with CMLYANG Yi1*, ZHANG Yi-ting2*, LI Zhi-xiong1*, CHEN Shao-hua3, YANG Li-jian3, LI Yang-qiu3(1. Grade 2005, Department of Clinical Medicine; 2. Grade 2006, Department

5、of Clinical Medicine; 3. Institute of Hematology; Medical College, Jinan University, Guangzhou 510632, China) Abstract：Objective To investigate the distribution and clonality of TCR V repertoire T cells in peripheral blood mononuclear cells with chronic myeloid leukemia (CML) in chronic phase (CP) a

6、nd complete remission (CR) . Methods The CDR3 of TCR V 8 subfamily genes were amplified in mononuclear cells of peripheral blood from patients with CML in CP (8 cases) and in CR (8 cases), to observe the usage of TCR V repertoire by using RT-PCR. The positive PCR products were further labeled with f

7、luorescent and analyzed by genescan technique for the CDR3 size, to evaluate clonality of the detectable TCR V T cells. 10 cases healthy adults served as controls. Results The mean value of detectable TCR V subfamilies were（3.25±0.89）in patients with CML-CP, predominantly in V1，2 and V3, wherea

8、s（3.5±0.76）of 8 V subfamily T cells were expressed in patients with CML-CR, predominantly in V1,2, 3 and V8. There is no significant difference between the above groups and the healthy adults（3.5±0.52）. In additional, a higher frequency expression of V8 could be found from peripheral blood

9、 of CR phase(5/8) rather than from CP phase(2/8) and healthy adults(3/10). Genescan analysis showed that the majority of PCR products from both CML and healthy adults displayed clonal expansion, predominantly in V1,V2 and V3. Clonal expanded V7 subfamily T cells, however, could be identified from tw

10、o patients in CR phase but not in all of 10 healthy adults. Conclusions The similar distribution and clonal pattern of TCR V repertoire T cells have been showed in peripheral blood from three groups，suggesting that the cellular immunosuppression of patients with CML might not mainly involve in the a

11、lteration of TCR V repertoire. In CML-CR groups, the expression and clonal pattern of some V repertoire are different from other groups, it remains an open question.Keywords: CML; T-cell receptor V gene; Genescan; T-cell clonality多数血液肿瘤病人均存在明显的细胞免疫功能缺陷，我们前期研究已发现慢性粒细胞白血病（CML）病人外周血T细胞中T细胞受体（T-Cell rec

12、eptor , TCR） V和Vb均存在限制性利用和克隆模式的改变1，2，临床观察表明这种限制性表达程度与CML患者的免疫缺陷状况和病情恶化程度相关。为了解CML患者的细胞免疫抑制是否也涉及TCR V亚家族T细胞，本研究进一步利用RT-PCR-基因扫描法分析CML 慢性期（CP）和缓解期（CR）的病人外周血TCR V 8个亚家族的分布和克隆性情况，从而可以更全面地了解CML患者的 T 细胞免疫状态。1 材料和方法1.1 材料收集经细胞形态学、细胞化学、细胞和分子遗传学确诊的初发未治的慢性期和缓解期的CML患者外周血各8例，编号为B1-B8和C1-C8，健康成人志愿者外周血10例作为对照，编号为

13、N1-N10。常规分离单个核细胞。1.2 RNA提取和cDNA合成RNA提取应用TRIzol试剂盒（Invitrogen, USA）并应用随机引物和反转录酶试剂盒（Superscript，Invitrogen, USA）反转录合成cDNA第一链。均按常规方法进行。1.3 引物设计根据TCR中 V的 8个亚家族分别设计8条V引物作为上游引物（V18），并在C区设计一下游引物C，另外在C引物上游再设计一荧光素标记的C-fam引物作为标记PCR产物和基因扫描之用（表1）。引物均由德国柏林 TIB MOLBIOL公司合成3表1 用于 TCR V 基因检测的引物序列引物序列V15'-GTGGTC

14、GCTATTCTGTCAACT-3'V25'-GCTCCATGAAAGGAGAAGCGA-3'V35'-CACTGTATATTCAAATCCAGA-3'V45'-TGACACCAGTGATCCAAGTTA-3'V55'-TCTGCACATTGTGCCCTCCCA-3'V65'-TATCATGGATTCCCAGCC-3'V75'-GAACATCACAGCCACCCAGACCG-3'V85'-ACTTCCAGAAAGCAGCCAAA-3'C5'-AACAGCATTCGTA

15、GCCCAAGCAC-3'C- Fam5'-Fam-GTTTATGGCAGCTCTTTGAAGGT-3'1.4 RT-PCR扩增利用TCR V（18）亚家族上游引物和C下游引物扩增各样本cDNA，总反应体积为 20 L，其中含 1L cDNA，任一 V引物和其相应的下游引物C（0.5 mol/L），0.1 mmol/L dNTP，1 U Taq 聚合酶，1.5 mmol/L MgCl2和 1 × PCR 缓冲液（Promega, USA）。反应在 PCR 扩增仪（Biometra, Germany）中进行，共进行 40 个循环，每一循环包括：94 1 min（

16、首次 3 min），60 1min 和 72 1 min（末次 6 min），取8L PCR产物和2L溴酚兰于2.5琼脂糖中电泳分析PCR结果。1.5 T细胞克隆性分析1.5.1 Runoff reactions（标记PCR产物）10 L 的反应体系含 2 L 未标记的 PCR 产物，0.1 mol/L C-fam引物，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP , 1 U Taq 聚合酶和 PCR 缓冲液。PCR 共进行 35 个循环，退火温度为 66 ，余同上。1.5.2 基因扫描分析（CDR3长度分析）取2L荧光素Fam标记的PCR产物加入高质量的去离子甲酰胺（Hi

17、-Di Formamide，ABI）与标准品(GENESCANTM-500-LIZTM，Perkin Elmer，ABI，其中含有荧光素 LIZ 标记的不同大小的 DNA 片段)按体积 201 比例配好的10L混合液，94 变性 4 min，然后将样品加入 96 孔板，直接装载到已灌好 POP-4 （Performance Optimized Polymer-4，ABI）胶的 3100 DNA 序列分析仪上进行电泳，电泳所采集结果经基因扫描分析软件分析产物的长度和荧光强度。当PCR产物中所含DNA扩增片段大小一致，其电泳时的迁移率完全相同，在同一时间点通过扫描，所显示的结果为一单峰图像，提示P

18、CR产物来自于CDR3长度完全相同的T细胞，即单克隆的细胞，而一主峰和少数小峰图象提示产物主要来自同一克隆即为寡克隆性；而多峰图象提示多克隆性1,2。1.6 统计学分析 采用SPSS 11.5 统计软件进行t 检验。2 结 果2.1 TCRV亚家族的表达特点： 8例CP期CML病人外周血T细胞平均表达（3.25±0.89）V个亚家族，主要以V1、V2和V3的表达为主，而8例CR期病人则平均表达（3.5±0.76）个V亚家族，主要集中在V1、V2、V3和V8中表达；从表达个数上看，前两组与健康对照组（3.5±0.52）比较尚无统计学差异。而从各个亚家族的表达情况看，

19、三组样本外周血T细胞均全部表达TCR V1和V2亚家族；CML-CR病人的V8表达频率（5/8）略高于健康人（3/10）和CML-CP病人（2/8）； TCR V4、5和V6在CP期和CR期病人外周血中均未能检测到，而这几个亚家族在健康人中也未能检测到（V4和V5）或检测率很低（V6）（图1）。图1 TCR V亚家族在各组中的表达情况2.2 T细胞克隆性分析结果基因扫描结果显示，绝大多数病人（6/8例CP和7/8例CR）和健康人（9/10例）外周血TCR V亚家族T细胞均存在克隆性增殖现象，主要以V1、2和V3为主，有的还同时在不同亚家族中呈克隆模式的改变。但在CML-CR病人中，表达V7亚家

20、族的两例样本均呈克隆性增殖，这在10例健康人中均未检测到。（图2，3）多克隆寡克隆阴性双克隆寡克隆趋势图2 TCR V亚家族在各组中的分布和克隆性特点图 3 2例CML-CP（B4,B6）和2例CML-CR（C4,C8）TCR V亚家族的基因扫描结果 B1的V1和V2均呈多克隆图像，B4(V1,3),B6(V1-3),C4(V3,7)和C8(V2,7,8)均呈克隆模式改变，分别呈寡克隆或双克隆 C4-V1 B6-V1 B6-V2B6-V3 C4-V2 C4-V3 C4-V7C8-V7C8-V2C8-V1C8-V8 B4-V1B4-V2B4-V3 B1-V1B1-V2 3 讨 论TCR有、和 四

21、种肽链，分别以TCR和TCR两种异源二聚体形式表达于T 细胞表面，T细胞可根据其表面表达的TCR类型而分为+T细胞和+T细胞，前者为外周血T细胞的主要成分（90%），+T细胞在外周血中仅占1%10%。+T细胞的免疫应答为MHC限制性，而+T细胞则为非MHC限制性。尽管+T细胞的功能尚不完全清楚，但近年的研究提示其在抗病毒和抗肿瘤中具有重要的作用6,7。我们的系列研究主要通过分析TCR V和V亚家族分析已经提示CML病人存在明显的T细胞免疫功能缺陷1,2，而有关TCR V亚家族的谱系改变如何则未有研究资料。故在既往研究的基础上，本研究继续分析和比较CML-CP和CML-CR病人TCR V亚家族基

22、因谱系的变化情况。TCR基因由重组的VDJ和C区组成，TCR的可变区（V区）可以分为8个亚家族。由于TCR 基因重排时所形成的 CDR3 高度多样化，不同克隆 T 细胞的 TCR 重排时，其 CDR3 长度和序列有所不同，据 TCR 基因的特点，采用 RT-PCR 扩增和基因扫描法即可检测各亚家族 T 细胞的分布和克隆性，故本研究采用该方法分析了CML病人CP期和CR期各8例，结果显示8例 CML-CP病人外周血T细胞与CR组以及健康对照组一样全部表达TCR V1和V2亚家族，TCR V4、5和V6在CP期和CR期患者外周血中均未能检测到，而这几个亚家族在健康人中也未能检测到或检测率很低，与T

23、CR V和V基因谱系在健康人外周血中呈全谱系表达和多克隆分布的特点有所不同，多数研究都认为TCR V亚家族在健康人中有选择性利用的情况，主要以V1和V2为主8-9。从CML病人的TCR V谱系分布特点可见其与健康人没有明显的差异，有一点不同的是CML-CR病人的V8的表达频率（5/8）略高于健康人（3/10）和CML-CP病人（2/8），这是否与其T细胞免疫恢复有关有待进一步扩大标本量进行研究。在未受任何抗原刺激下，TCR基因的重排是随机的，表现为多家族和多克隆性，而当受到特异性抗原刺激后，TCR谱系会呈现优势表达并出现克隆模式的改变。在正常情况下，TCR V亚家族呈多克隆性，然而与V亚家族有

24、所不同，TCR V 亚家族在正常人中也常可检测到克隆性增殖的T细胞，这种克隆模式的改变还有随年龄增加而明显的趋势9。本研究在大部分健康人和6/8例CP期病人外周血TCR V亚家族中均检测到了克隆性增殖的T细胞，并均主要集中在V1、2和V3中，该结果也提示CML病人V亚家族的克隆增殖模式与健康人类似，但值得注意的是表达V7的两例CR期样本均呈克隆模式的改变，V7在健康人中出现频率很低，这种变化是否与某些抗原特异的增殖有关，还有待进一步研究。总之，本研究首先提供了CP期和CR期CML病人外周血T细胞TCR V基因多样性变化的情况，为比较全面了解CML病人的T细胞免疫状态补充了新的资料。 参考文献:

25、1 陈思,李扬秋,陈少华,等.CML 相关TCRV亚家族T 细胞的克隆性分布特点J.肿瘤防治研究，2007,34(3):168-170. 2 耿素霞,李扬秋,陈少华,等.CML患者CD4+和CD8+T细胞的TCR V基因谱系和克隆性分析J. 中国免疫学杂志，2007，2(2):157-160.3 Yamamoto T, Hara T, Nanba E, et al.Abnormal Expansion of Peripheral T Cells in Patients with Neurologic DisordersJ. Brain Behav Immun, 1997,11(3):157-1

26、66.4 Evans PS, Enders PJ, Yin C, et al. In vitro stimulation with a non-peptidic alkylphosphate expands cells expressing Vgamma2-Jgamma1.2/Vdelta2 T-cell receptorsJ. Immunology, 2001,104(1): 19-27.5 Hirokawa M, Horiuchi T, Kawabata Y, et al. Reconstitution of gammadelta T cell repertoire diversity after human allogeneic hematopoietic cell transplantation and the