微生物检验员培训资料

1、一. 基础知识（一） 微生物基础知识1. 培养基培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98100下融化，于45以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。 任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基

2、的灭菌采用高压蒸汽灭菌。（二） 消毒与灭菌知识5.2灭菌方法 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。 加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。 （三） 洁净室行为规范（四） 实验室安全知识二. 基本操作（一）培养基配制、灭菌、使用和保藏1. 配制1.1 按照培养基瓶签所示，准确称

3、量一定培养基干粉于合适的容器，加纯化水溶解。1.2 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。1.3 如需分装，应先加热搅拌，待培养基完全溶解并均一后进行。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。 1.4 培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。 2. 灭菌2.1 按照培养基瓶签所示的灭菌条件

4、（温度和时间）对配制好的培养基进行高压灭菌。配制好的培养基应在2小时内进行灭菌。3. 保藏和使用3.1 液体培养基管置专用不锈钢筒内， 225避光保存，3周内使用。在不锈钢筒贴标签，标明培养基名称、培养基配制日期、高压灭菌编号等信息。不同批次培养基不得置于同一不锈钢筒内。3.2 平板和接触皿置专用不锈钢筒，标明培养基名称、制备日期、培养基的灭菌编号，用保鲜膜密封筒口后，225避光保存，3周内使用。不同批次平板和接触皿不得置于同一容器内。3.3 培养基使用之前应预培养，合格后方可使用。营养琼脂培养基：25-35，预培养3天。硫乙醇酸盐液体培养基：25-35，预培养2天。虎红琼脂培养基和改良马丁培

5、养基：23-28，预培养3天。（二） 消毒剂配制和使用1. 0.1%新洁尔灭溶液的配制和使用1.1基准处方：5%新洁尔灭溶液20ml 注射用水980ml1.2 作为手部和衣服浸泡消毒，设备、操作台面和洁净室六面擦洗消毒以及地漏消毒用，有效期为3个月。2. 75%酒精的配制与使用2.1 基准处方：95%乙醇790 ml 纯化水210 ml2.2 作为消毒双手（手套），擦洗设备、操作台等表面消毒剂，有效期为14天。3. 2%来苏儿（甲酚皂）溶液的配制和使用3.1 基准处方：50%来苏儿（甲酚皂）溶液40 ml 纯化水960 ml3.2 拖擦地面用，临用前配制。4. 甲醛熏蒸作为环境空气和表面消毒剂

6、。操作步骤：关闭风机无关人员撤出消毒区，操作人员戴防护手套和防毒面具将设备及器具暴露于空气中将盛有甲醛溶液的不锈钢饭盒置不锈钢台面上层饭盒倒入需要体积的甲醛（10ml/m3，每只饭盒不得多于250ml），下层饭盒倒入300ml 95%或无水乙醇点燃下层饭盒内乙醇，操作人员迅速离开保留被消毒空间的甲醛气体至少8小时消毒结束后，开启风机，直至消毒空间无甲醛刺激性气味，方可进入工作。5. 臭氧消毒5.1 作为环境空气和表面消毒剂。5.2 操作步骤：关闭风机无关人员撤出消毒区，操作人员戴防护手套和防毒面具将设备及器具暴露于空气中设定消毒时间，开启臭氧法生器面操作人员迅速离开保留被消毒空间的臭氧气体至少

7、8小时消毒结束后，开启风机，直至消毒空间无臭氧气味，方可进入工作。6. 消毒剂交替使用6.1 隔周交替使用0.1%新洁尔灭溶液和75%酒精进行手部消毒。6.2 隔周交替使用0.1%新洁尔灭溶液和2%来苏尔溶液拖擦地面。6.3 洁净区每月对空气消毒一次，甲醛消毒6个月一次，其余时间采用臭氧消毒。（三） 微生物室设备与设施1. 高压灭菌器1.1原理：高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽,待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度

8、。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。1.2 操作步骤：向高压灭菌器灭菌舱内加水至排泄管口高度放入待灭菌物品，关闭灭菌器盖开启电源，设置灭菌温度和时间以及排气温度按start键开始灭菌（依次经历：升温排气升压保压降压排气降温）灭菌结束后，取出灭菌物品，关闭电源清洁灭菌舱。1.3 注意事项待灭菌物品间应留适宜间隙，便于蒸汽穿透。当温度在80以上时，盖将不会被打开；当温度低于60时，即可开盖。每次灭菌前应保持灭菌舱内水位在规定线以上。 干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。 .2干燥箱灭菌 将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太

9、密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160170并恒温12h，注意勿使温度过高，超过170，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120持续30分钟即可。温度降至6070时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。 用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。 5.2.2.3火焰灭菌 直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。 2. 烘箱（干热灭菌）2.1 原理：通过使用干热空气杀灭微生物。一般是

10、把待灭菌的物品放入电烘箱中烘烤，加热至160170维持2h（除热原要求250维持1h）。2.2 操作步骤：将待灭菌物品正确包扎与加塞，以免灭菌后被外界污染将包扎好的物品放入干燥烘箱内3. 超净工作台4. 培养箱5. 集菌仪6. 传递窗7. 洁净室（四） 平板和接触皿制备将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到4550,立刻倒平板。（五） 微生物数量测定三. 检验项目（一） 微生物限度检查（二） 无菌检查（三） 环境监控检查（四） 模拟灌装检查（五） 培养基灵敏度检查（六） 菌株传代与保藏四. 其它（一） 微生物形态观察（菌落形态、染色与镜检）（二） 微生物分离纯化培养（三） API法鉴定微生物（四

11、） PCR法鉴定微生物7思考 7.1制备培养基的一般程序是什么？ 7.2做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？ 7.3灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？ 4试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。 5高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？标准菌种的保藏形式 我国提供的标准菌种通常是以冻干粉的形式包装于熔封的厚玻璃容器中。在这种容器中，微生物通常与赋形剂共存，由于缺乏生长必须的环境条件，一般呈休眠状态。纯培养 所谓微生物的纯培养是指在一个微生物的菌落形成单位中，所有的微生物细胞或孢子都属于生物学的同一个种。严格地说，纯培养是在培养基上由一个细胞或孢子分裂、繁殖而产生的后代。在该细胞或孢子的

12、生长过程种，不受其他微生物的侵犯，不会在培养物中产生另外微生物种的后代，在整个生长过程中不发生变异或死亡。 获取纯培养的工作环境1、洁净工作室：环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区域内，全过程必须无菌操作，防止微生物污染。2、无菌隔离舱获取纯培养的接种工具1、接种环2、接种针3、接种铲4、接种钩5、其他玻璃器械获取纯培养的其他器具1、玻璃器皿：如各种规格培养皿。2、微生物实验室常用的设备，如高压灭菌锅、恒温培养箱等获取纯培养的主要技术移植（又称接种） 微生物的移植（或称接种）是指将微生物接种在培养基上的操作。移植（又称接种）的两种方式划线 和穿刺 1、划线法是指用接种工具将微生

13、物细胞移植在固体培养基斜面或平板上的一种方法 。2、穿刺法是指用接种工具将微生物细胞移植到固体或半固体培养基内的一种方法。 影响集菌培养效果的若干因素n 温度n 渗透压n 氧气n 光n pH值和氧化还原电位n 培养基n 抗生素验证纯培养的主要依据1、用显微镜观察时，全部的生物个体是相似的，如果是细菌，对革兰氏染色反应应当是一致的。2、将培养物制成悬液，重新倾注平板，或平板划线培养后，所形成的全部菌落的形态应该是相似的。如果是细菌，将重新形成的菌落各作穿刺培养，其培养特征应当是一致的。3、从重新分离的各菌落作生理特征观测时，如对氮源的利用，对糖类的发酵或同化以及其他生理生化的测定，应呈现出一致性

14、。 定期移植保藏法 一般步骤为：将菌种接种在所要求的培养基上，置最适温度下集菌培养。得到健壮的菌体（如有性孢子、无性孢子或细胞等）后，放于温度较低、干燥处保藏，并且每隔一定时间重新移植培养一次。 定期移植保藏法1、细菌置46保藏，芽孢杆菌每36个月移植一次，其他细菌每月移植一次。 2、放线菌于46保藏，每3个月移植一次。 3、酵母菌于46保藏，每46个月移植一次。 4、丝状真菌于46保藏，每3个月移植一次。 5、担子菌于46保藏，每3个月移植一次。6、保藏的湿度通常在5070为宜。 定期移植保藏法1、需定期检查2、移植进行时，应仔细核对3、集菌培养完成后，应比较培养特征4、应注意观察各代之间的

15、变化琼脂斜面低温保藏法1、菌种的典型菌落接种至斜面，规定的温度和时间培养，充分生长，硅胶塞换成无菌橡胶塞。46 冰箱保藏a:13个月移植一次，继续保藏。b:用半固体高层培养基穿刺培养，可保藏半年至一年。琼脂斜面低温保藏法n 适用细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏n 优点：简便、大多数微生物适用n 缺点：保藏期短；传代次数多；容易发生变异及污染。n 生孢梭菌用硫乙醇酸盐培养基、乙型溶血性链球菌及肺炎球菌用血肉汤（琼脂）培养基液体石蜡保藏法 一般步骤为：准备液体石蜡并灭菌去水备用。获得需要保藏菌种的纯培养，将液体石蜡注入培养容器中，并完全覆盖培养基。 液体石蜡液面以高出培养基上端0.51cm为宜 46

16、 冰箱保藏液体石蜡保藏法甘油冷冻保藏法n 将保藏菌种接种琼脂斜面上，适宜温度下培养适宜时间，用无菌接种环轻轻刮取菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦使菌种充分扩散到无菌水中，调证菌液浓度，向已制备好的菌悬液加入等体积的20无菌甘油，轻轻振试管管，使内容物充分混合，分装于无菌小管。甘油冷冻管最好在-30 贮存。沙管保藏法n 制备沙管n 培养接种n 制备菌悬液n 混菌n 干燥n 保藏n 适合保藏芽孢杆菌、梭菌、放线菌和一些丝状真菌。 土壤保藏法n 用土壤替代沙管保藏法中的河沙，其余操作与沙管保藏法相同n 适合保藏土壤细菌、放线菌和丝状真菌，时间为26年。 硅胶保藏法n 用硅胶替代沙管保藏法中的

17、河沙，其余操作与沙管保藏法相同n 适合保藏酵母菌和某些丝状真菌 滤纸保藏法n 保藏微生物细胞或孢子的载体为滤纸。n 对细菌、酵母菌、丝状真菌等都有一定的效果，有些菌种最长可达17年 。 明胶片保藏法n 制备无菌营养明胶n 制备无菌石蜡滤纸n 微生物培养并制成浓厚的悬液n 在悬液中加入营养明胶n 将含微生物细胞或孢子的营养明胶滴于石蜡滤纸表面n 干燥n 将形成的明胶片密封保藏麸皮保藏法n 我国历史悠久的微生物保藏法n 适于保藏根霉、曲霉、青霉、红曲霉等属和赤霉菌 梭氏真空干燥保藏法n 在小试管中放置菌悬液n 小试管在大试管中放置n 大试管在真空状态下干燥n 密封大试管液体直接干燥保藏法n 需要加

18、入保护剂n 干燥之前不需冻结n 在干燥过程中为增大蒸发面积，可加入多孔材料n 干燥后的容器应熔封蒸馏水保藏法n 最为简便的微生物保藏法n 微生物细胞或孢子保藏在蒸馏水中n 保藏的容器应密封n 适于保藏棒状杆菌、土壤杆菌和假单孢菌等 液氮冰箱超低温保藏法n 需专用设备液氮超低温冰箱n 菌悬液密封于安瓿管内，控速冻结n 国外已普遍采用n 保藏时间长冻结真空干燥保藏法n 历史悠久，又称冻干法n 不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用该法n 适用面广n 保藏时间可达10年以上n 多为菌种保藏机构采用冻结真空干燥保藏法n 密封性好，可避免保藏期间的污染n 保藏容器体积小，方便携带和贮藏n 保藏时间更长

19、，变异概率更低普通微生物实验室适用的保藏技术n 琼脂斜面低温保藏法n 液体石蜡保藏法n 低温冷冻保藏法n 甘油冷冻保藏法琼脂斜面低温保藏法n 细菌置46保藏，芽孢杆菌每36个月移植一次，其他细菌每月移植一次。 n 放线菌于46保藏，每3个月移植一次。 n 酵母菌于46保藏，每46个月移植一次。 n 丝状真菌于46保藏，每4个月移植一次。 n 担子菌于46保藏，每3个月移植一次。n 保藏的湿度通常在5070为宜。 菌种保藏的一般规定1、菌种“代”的确定：2005版药典规定，以干燥菌种管为第“0”代，由此得到的第一批子代为第一代，以此类推。2、菌种传代次数规定：2005版药典规定不超过5代。3、菌

20、种应专人保藏、专柜贮藏，认真做好登记，统一编号，按期传代，并做好有关检验记录。4、保存菌种传代或冻干均应填写专用记录，菌种管上应有标签，表明菌种编号、代次、批号、日期。5、过期菌种应及时处理、登记，经121 30分钟灭菌消毒。实验室菌种传代操作步骤n 1、接种前用1：1000新洁尔灭擦拭工作台面，然后开紫外灯消毒30分钟。n 2、自冰箱取出保存工作用菌种，室温放置20分钟；温度平衡后才能传代。n 3、实验人员进入缓冲间，换鞋、穿无菌衣、戴口罩，用1：1000新洁尔灭溶液消毒双手，并将培养基及菌种移入阳性菌接种室。n 4、点燃酒精灯，将菌种管塞子，通过火焰转动使稍稍松动，以免接种时粘着打不开。n

21、 5、接种操作：左手拿住菌种管，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒，将白金耳烧红约30秒，杆部通过火焰灭菌。挑取少量菌苔；另取，照上述方法在火焰旁打开塞子，将白金耳伸入管内斜面培养基的底部，从下到上将白金耳轻贴斜面培养基的表面作曲折移动。n 5、接种后，将斜面置规定温度、时间培养。取出观察，菌种生长良好，换橡皮塞，贴上标签，放入冰箱保存。n 6、细菌一个月传代一次，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉可三个月传代一次。菌种管理n 1、标准菌种必须从认可的菌种收集途经获得；实验室必须建立和保存所有菌种的收集、贮藏、保存、确认试验的记录。n 2、实验室应有文件管理标准菌种（从原始菌

22、种到工作用菌种）。该程序应包括：a:标准菌种必须定期传代，并做确认试验，包括实验室在所需要关键诊断指标，实验室必须记录并保存。b：每一子菌种都应以适当标签、标记来表示名称、标准号、接种日期和传代日期。C:每一子菌种都应以标记从原始菌种传代到工作用菌种的代数；记录菌种生长的培养基及培养条件；菌种生存条件等。过期菌种处理n 过期菌种应及时清理、登记，并经121 、30分钟高压消毒灭菌。例1：金黄色葡萄球菌传代保藏技术n 1、购置金黄色葡萄球菌（如我所提供的菌种为第二代菌种），假定购置日期为5月21日。n 2、准备10支营养琼脂斜面，其中2支用于保藏，其余8支用于当月实验。n 3、于5月22日打开菌

23、种管，接种菌种至上述10支斜面，35 培养1618小时。n 4、将10支第三代菌种管做好标签，置适宜温度保藏。n 5、5月22日至6月22日，可以使用上述第三代菌种管。n 6、至6月22日，重复步骤2，得第四代菌种管。n 7、至8月22日前，重新购置原种管。例2：黑曲霉的传代技术n 1、制备孢子悬液：取灭菌水或生理盐水35ml，分23次小心滴加至菌种管内（试管斜面），反复振摇。倾取孢子悬液置另一灭菌试管。n 2、涂布接种：用灭菌滴管吸取悬液滴加至改良马丁琼脂培养基斜面，每管滴加23滴，转动试管，使悬液与斜面表面充分接触菌种确认试验n 包括以下几个方面：1、菌落生长情况：目测2、染色镜检：3、生

24、化试验；(1)糖醇代谢试验 （2）氨基酸和蛋白质代谢试验 （3）碳源和氮源利用试验 （4）酶类试验 （5）其他试验短小芽孢杆菌确认该菌未发生变异的主要方法为：1、通过显微鉴别，为不呈链状排列的杆菌，革兰氏染色为阳性。2、营养琼脂斜面上菌苔光滑，薄，闪光，蔓延，不粘着，常常是浅黄色。 3、生化试验可选做明胶穿刺、淀粉水解和硝酸盐还原 ，结果为明胶缓慢液化，淀粉水解阴性，硝酸盐还原阴性。枯草芽孢杆菌确认该菌未发生变异的主要方法为：1、通过显微鉴别，为呈链状排列的杆菌，不形成荚膜，革兰氏染色为阳性。2、营养琼脂斜面上菌苔生长丰厚，粗糙，不透明，不闪光，蜡质，蔓延，奶油色至微褐色。 3、生化试验可选做

25、明胶穿刺、淀粉水解和硝酸盐还原，结果明胶呈漏斗形至层状液化，淀粉水解阳性，硝酸盐还原阳性。大肠埃希菌确认该菌未发生变异的主要方法为：1、通过显微鉴别，为成对和呈短链排列的近球形的杆菌，一般不形成荚膜，革兰氏染色为阴性。2、营养琼脂斜面上菌苔通常白色，有时带黄白色，湿润，闪光，蔓延生长。 3、生化试验可选做明胶穿刺和靛基质试验、甲基红试验、V.P.试验和柠檬酸盐利用试验，结果不液化明胶，靛基质试验和甲基红试验阳性，V.P.和柠檬酸盐利用试验阴性。大肠埃希菌 该菌为微生物限度检查规定不得检出的控制菌，有一整套完整的鉴定手段，也可参考该方法用于判断所保藏的菌种有无发生变异。 该鉴定方法主要内容即为经典的IMViC试验，结果为+-。铜绿假单孢菌确认该菌未发生变异的主要方法为：1、通过显微鉴别，为单个，成对或呈短链排列的杆菌，有运动性，革兰氏染色为阴性。2、营养琼脂斜面上菌苔生长旺盛，薄，白色，闪光，培养基变为绿色至暗褐色或黑色，发荧光。 3、生化试验可选做明胶穿刺、吲哚和硝酸盐还原试验，结果迅速液化明胶，液体呈浅黄绿色或浅蓝绿色，吲哚试验阴性，硝酸盐还原试验阳性。