微生物学实验室常用试剂与培养基

1、微生物学实验室常用试剂与培养基第一节常用试剂及其使用方法一、诊断用纸片 杆菌肽纸片（0.04U/片）：抑菌圈>10mm为敏感。质控菌株: D群链球菌阴性, A群链球菌阳性。SMZ纸片（1.25g/片、23.75g/片）：出现抑菌圈即为敏感。质控菌株：D群链球菌阳性， A群链球菌阴性。 新生霉素纸片（5.0g/片）：抑菌圈16mm为敏感。质控菌株：表皮葡萄球菌阳性，腐生葡萄球菌阴性。 O129纸片、奥普托欣（Optochin）纸片：参见第五节生化试验培养基。二、诊断用血清1.沙门菌属诊断血清A-F群O多价诊断血清。 特异O群因子诊断血清：常用的有O2，O4，O7，O9，O10诊断血清。 特

2、异H因子诊断血清常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子诊断血清。2.志贺菌属诊断血清志贺菌属4种多价血清：痢疾志贺菌、血清，福氏志贺菌多价血清及分型血清（16型），宋内志贺菌诊断血清，鲍氏志贺菌多价血清及分型血清。3.致病性大肠埃希菌诊断血清肠致病性大肠埃希菌（EPEC）诊断血清，产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）诊断血清，肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）诊断血清，肠出血性大肠埃希菌（EHEC）诊断血清O157： H7。4.霍乱弧菌O1、O139混合多价诊断血清及稻叶、小川、彦岛O139分型血清5.脑膜炎奈瑟菌多价血清及分群血清 6.链球菌分类诊断血清 7.肺炎链球菌诊断血清8

3、.耶尔森菌诊断血清三、常用染色液1.革兰染色液 结晶紫溶液 A液：结晶紫 20g，95%乙醇20 ml； B液：草酸铵 0.8g，蒸馏水80 ml。染色前24h将A液、 B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。 碘液:碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。将碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升蒸馏水, 使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至碘、碘化钾完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。 脱色液：95%乙醇 复染液：沙黄2.5g，95%乙醇100ml为贮存液，取贮存液10ml，加蒸馏水90ml为应用液。2.抗酸染色液 碱性复红染色液：

4、 萋纳石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和溶液10ml，5%石炭酸溶液90ml。脱色液：浓盐酸3ml，95%乙醇97ml。复染液(吕弗勒美蓝液)：美蓝乙醇饱和溶液30ml，100g/L氢氧化钾溶液0.1ml，蒸馏水100ml。 金胺O-罗丹明B染色液：罗丹明B液：罗丹明B0.1g加蒸馏水100ml。1g/L金胺O液：金胺O液0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸 5ml,混匀。3%盐酸乙醇。稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液100ml,加蒸馏水90ml,混匀。3.鞭毛染色液(改良Ryu法)A液：5%石炭酸10ml，鞣酸2g，饱和硫酸铝钾溶液 10ml； B液：结晶紫乙醇饱和液。应用液A液10份,B液1份,

5、混合,室温存放备用。4.异染颗粒染色液甲液：甲苯胺蓝 0.15g，孔雀绿 2g/L，95% 乙醇2.0ml，蒸馏水100ml。乙液：碘 2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml。 先将碘化钾加入少许蒸馏水(约2ml),充分振摇,待完全溶解,再加入碘,使完全溶解后, 加蒸馏水至300ml。5.荚膜染色液 印度墨汁或50g/L黑色素水溶液5g/L苯胺蓝水溶液。第二节 基础培养基一、液体基础培养基1.蛋白胨水用途用于细菌靛基质试验；一般细菌培养和传代。 配法蛋白胨（或胰蛋白胨）10g，氯化钠 5g，蒸馏水1L。将上述成分溶于水中，校正pH 至7.2,分装试管，每管23ml，置121灭菌15min备用。质量

6、控制大肠埃希菌生长良好，靛基质阳性；伤寒沙门菌生长良好，靛基质阴性。2.营养肉汤用途一般细菌的增菌培养，加入1%的琼脂粉亦可作营养琼脂。配法蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L。将上述成分称量混合溶解于水中，校正pH至7.4，按用途不同分装于烧瓶或试管内。经121灭菌15min，作无菌试验后冷藏备用。质量控制金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、化脓性链球菌生长良好。保存置冰箱3周内用完。3.牛肉浸液培养基用途细菌培养最基础的培养基，除用于一般细菌的培养外，又可以作营养琼脂及其它培养基的基础。配法新鲜除脂牛肉 500g，氯化钠5g蛋白胨10g，蒸馏水1L。先将牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切块绞

7、碎。称取500g置容器加入蒸馏水1L，搅匀后置冰箱过夜，次日煮沸加热30min，并用玻棒不时搅拌用绒布或麻布进行粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。在过滤中加入蛋白胨10g、氯化钠5g溶解后，用氢氧化钠溶液校正pH至7.67.8，并加热煮沸10min，补充蒸馏水至1L，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，经12115min灭菌备用。用法根据用途不同可以制成营养肉汤，以此为基础制成其它培养基。如制作固体培养基，加入琼脂15 20g/L即可。质量控制金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌等均生长良好。保存置4冰箱内可以使用较长时间。注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量为35g/L。二、固体基础培

8、养基1.营养琼脂用途一般细菌和菌株的纯化及传种。 配法蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂粉（优质）12g，蒸馏水1L。将上述成分(除琼脂外)溶于水中，校正pH 7.27.4后加入琼脂，煮沸溶解，根据用途不同进行分装，经121灭菌15min，倾注平板或制成斜面，冷藏备用。 质量控制金黄色葡萄球菌菌落呈浅黄色；痢疾志贺菌菌落无色；铜绿假单胞菌菌落无色或浅绿色。保存置4冰箱保存，2周内用完。2.血琼脂培养基用途一般病原菌的分离培养和溶血性鉴别及保存菌种。配法pH7.47.6牛肉浸液琼脂 100ml，脱纤维羊血(或兔血) 510ml。将血琼脂基础经121灭菌15min，待冷却至50左右以无菌手

9、续加入羊血，摇匀后立即倾注灭菌平皿内，待凝固后，经无菌实验冷藏备用。质量控制化脓性链球菌ATCC 19615生长良好，-溶血；肺炎链球菌ATCC 6303生长良好，-溶血；表皮葡萄球菌ATCC 12228 生长良好,不溶血。保存置4冰箱，1周内用完。3.巧克力琼脂培养基用途主要用于嗜血杆菌的分离培养，亦可用于奈瑟菌的增殖培养。 配法鲜牛肉浸出液1L，蛋白胨10g,氯化钠5g，琼脂粉12g，无菌脱纤维羊血或兔血100ml。将上述成分（除兔血外）加热溶解，调pH至7.2，置12115min高压灭菌，待冷至约85，以无菌方式加入兔血，摇匀后置85水浴中，维持该温度10min，使之成巧克力色。取出置室

10、温冷至约50，倾注平板或制成斜面备用。质量控制流感嗜血杆菌ATCC 10211、肺炎链球菌ATCC 6305生长良好，菌落典型。保存置4冰箱，1周内用完。4.胱氨酸胰化酪蛋白琼脂用途常用于测定脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及营养要求较高细菌的糖发酵试验。配法胱氨酸0.5g, 胰化酪蛋白20g,氯化钠5g，亚硫酸钠0.3g，琼脂3.5g，酚红0.0175g，蒸馏水1L。将上述成分（酚红除外）混合溶解，调pH至7.2，加入酚红指示剂。分装试管，115灭菌15min。用法用于测定糖发酵时，按需要加入各种糖溶液，将待检标本直接种于培养基管内，置35孵箱，1824h观察结果。培养基由红色变为黄色为阳性，不变

11、色为阴性。第三节保存和增菌培养基一、菌种保存培养基配法蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠3g，磷酸氢二钠2g，琼脂粉4.5g，蒸馏水1L 。 将上述成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.47.6，分装试管2/3左右高度，121高压灭菌15min，成为半固体培养基，备用。 质量控制培养基呈淡黄色半固体状。大肠埃希菌(ATCC25922)生长良好,动力阳性；福氏志贺菌(ATCC12022)生长良好,动力阴性；金黄色葡萄球菌(ATCC25923)生长良好,动力阴性。二、增菌培养基1.葡萄糖肉汤用途用于血液增菌。 配法蛋白胨(或月示胨)10g，氯化钠5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖3g，枸橼酸钠3g

12、，5g/L对氨基苯甲酸水溶液10ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml，青霉素酶1000U。 将蛋白胨、氯化钠混合于肉浸液中加热溶解，再加入葡萄糖、枸橼酸钠、对氨苯甲酸及硫酸镁，继续煮沸5min，并补足失水，调整pH至7.8。过滤分装，每瓶50ml，高压灭菌11520min后，每瓶加入青霉素酶50U，经无菌试验合格后，冷却备用。用法将采取的血液标本，以无菌手续注入培养瓶中（血液1ml，培养液10ml），置35培养箱内，每天1次取出观察结果。如有细菌生长，可出现数种不同的表现，应随时作分离培养，可选用血琼脂、伊红美蓝琼脂及巧克力琼脂平板等。无细菌生长表现的培养瓶，需连续观察7d，仍无细菌生长方可弃

13、去。在观察的过程中，至少应作两次分离培养。注: 枸橼酸钠为抗凝剂，可使血液加入培养基中不凝固。 对氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺类药物的抑菌作用。 硫酸镁主要抑制血液中存在的四环素、金霉素、新霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用。 本培养基近年来有许多改良配方，如加入0.3%0.5%酵母浸膏以增加营养；加0.2%核酸刺激细菌生长；加0.1%粘液素能被覆于细菌的表面，保护细菌免受抗体破坏；加入聚茴香脑磺酸钠（SPS）能中和补体的抗药作用从而提高检出率。2.血液增菌培养基 用途血液和骨髓液病原菌的增菌培养。 配法蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏粉3g，枸橼酸钠3g，磷酸氢二钾2g

14、，5g/L对氨基苯甲酸溶液5ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml， 4g/L酚红溶液6ml，青霉素酶50U，聚茴香脑磺酸钠(SPS) 0.3g，蒸馏水1L。 将上述成分（除酚红指示剂、青霉素酶外）混合加热溶解，校正pH至7.4，再加酚红，过滤分装每瓶3050ml，经121灭菌15min和3524h无菌试验备用。临用时每瓶加入1.52.5U青霉素酶。质量控制伤寒沙门菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化脓性链球菌ATCC 19615、肺炎链球菌ATCC 6305、金黄色葡萄菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27853均生长良好。3.亚硒酸盐增菌培养基用途沙门菌增菌

15、培养。 配法蛋白胨5g，乳糖4g，磷酸氢二钠4.5g，磷酸二氢钠5.5g，亚硒酸氢钠4g，蒸馏水1L。 先将亚硒酸盐加到200ml蒸馏水中，充分摇匀溶解。其它成分称量混合，加入蒸馏水800ml，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH7.07.1(通过调整磷酸盐缓冲对的比例来校正pH值)。最后分装于15×150mm的试管内，每管10ml。置水浴隔水煮沸1015min，立即冷却，置4冰箱保存备用。用法取新鲜标本1g或棉拭子采样直接种于该培养管内。摇动后置35培养过夜。如发现均匀混浊，管底有红色沉淀物，表示细菌生长。然后取培养物分离在选择性培养基上，如SS琼脂、麦康凯琼脂平板等，进

16、行培养。质量控制培养基应呈淡黄色或无色，透明无沉淀物。增菌灵敏度：伤寒沙门菌1×10-5，鼠伤寒及副伤寒沙门菌1×10-7。保存4保存，1周内用完。注： 亚硒酸盐，包括亚硒酸钠、亚硒酸氢钠均可使用，但以亚硒酸氢钠效果为好。 磷酸盐缓冲对中，两者的用量比例与亚硒酸盐及蛋白胨的品种有关。制备前应进行调试，其总量为10g/L。 在制备过程中，亚硒酸盐不能直接加热。隔水煮沸时间亦不能超过规定时间，否则亚硒酸盐会变质，生成红色沉淀物。 培养基应呈淡黄色，有红色沉淀物出现时不可再用。4.SS增菌液用途用于沙门、志贺菌的增菌。配法月示胨 2g，蛋白胨8g，牛肉膏3.5g，酵母膏2g，葡萄

17、糖2g，枸橼酸铁10g，硫代硫酸钠10g，亚硫酸钠0.7g，胆盐5.5g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0.1g，去氧胆酸钠(进口) 1.5g，煌绿0.005g，蒸馏水1L。 将上述成分加热溶于水中，调pH至7.1，分装试管（15×150mm），每管57ml，隔水煮沸5min备用。用法取粪便标本1g直接种于增菌液内，351618h培养，取出转种于分离培养基即可。 质量控制培养基应呈淡黄色或略呈淡绿色。伤寒沙门菌ATCC50096、福氏志贺菌ATCC12022 生长良好；大肠埃希菌ATCC25922 生长抑制。注： 切勿高压，隔水煮沸时间不超过5min。 煌绿用量应根据不同产品批号酌情增减

18、。5.碱性蛋白胨水用途霍乱弧菌增菌培养。配法蛋白胨 20g，氯化钠5g，蒸馏水100ml。 将上述成分溶解于水中,校正pH 至8.6，分装于试管810ml，经121灭菌15min备用。用法将待检标本接种到碱性胨水中，置35培养68h，霍乱弧菌呈均匀混浊生长，表面有菌膜出现。取表面菌液一白金环移种到碱性琼脂、庆大琼脂或TCBS琼脂平板上。必要时做第二次增菌。质量控制有条件的实验室可用标准菌株，一般临床实验室可用非01群弧菌，培养后生长良好者方可使用。霍乱弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌生长良好（6h）；大肠埃希菌ATCC25922不生长（6h）。保存置4冰箱，2周内用完。注：若在每升碱性胨水中

19、加入1%亚碲酸钾溶液0.51.0 ml，则成为亚碲酸钾碱性胨水，其增菌效果更为理想。第四节分离培养基一、革兰阳性杆菌分离培养基1.罗-琴改良培养基用途用于结核分枝杆菌培养。配法磷酸二氢钾2.4g，硫酸镁0.24g，枸橼酸镁(或枸橼酸钠) 0.6g，天门冬素3.6g，甘油12ml，蒸馏水600ml，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1L，2%孔雀绿水溶液20ml。先将磷酸盐、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素及甘油，加热溶解于600ml蒸馏水中。再添放马铃薯粉，边放边搅，并继续置沸水中加热30min，待冷却至60左右时，加入鸡卵液1L及孔雀绿溶液20ml，充分混匀后，用无菌操作分装于灭菌试管，每支56ml，塞

20、紧橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器内制成斜面，经851h间歇灭菌2次(或高压灭菌11520min)，待凝固后经无菌试验，4冷藏备用。用法取晨咳痰或其它体液标本，经消化处理和离心沉淀的浓缩液0.1ml（约2滴）滴种于培养基的斜面上，尽量摇晃，置355%10%二氧化碳温箱内培养14周，观察结果。凡在1周内发现生长的菌落，一般不可能是结核分枝杆菌；在2周后生长的菌落，奶油状，略呈黄色，粗糙突起，不透明，即取菌进行涂片染色镜检及鉴定。质量控制用结核分枝杆菌菌株作阳性培养试验。保存置4冰箱内24周有效。注： 本培养基由Lowenstein-Jenden设计的基础上改良。（2）本培养基pH约为6.0

21、左右，一般无须校正。（3）间歇灭菌的温度不宜超过90。 2.血清斜面培养基(吕氏血清斜面)用途用于白喉棒状杆菌培养。配法1%葡萄糖肉汤(pH7.6)100ml，无菌动物血清(牛、羊、猪、兔) 300ml。将上述成分混合后，分装于试管内，每管约45ml。斜插在血清凝固器内（或蒸笼）加热808530min，使血清凝固成斜面，冷却后放4冰箱内。取出后采用间歇灭菌法，85灭菌30min，连续3天，经无菌试验证明无杂菌生长即可应用。用法将喉拭子直接接种于上述斜面上，置35培养1624h。白喉杆菌在上述培养基上，菌落呈圆形，表面光滑、完整，9g/L氯化钠溶液中易乳化，用阿尔培脱染色，两极异染颗粒明显。注：

22、 所用血清不能含有防腐剂。 该培养基不能高热灭菌，以防破坏其中营养成分。 配制时所有器皿、棉塞等均应高压灭菌。3.亚碲酸钾血琼脂用途用于分离白喉杆菌。 配法蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉浸膏3g，葡萄糖2g，胱氨酸0.05g，1%亚碲酸钾45ml，脱纤维羊血100ml，琼脂2g，蒸馏水900ml。 先将蛋白胨、氯化钠、牛肉浸膏、葡萄糖和胱氨酸加水加热溶解，调pH至7.6，加入琼脂，高压灭菌11515min备用。待冷至50左右，用无菌操作加入已灭菌的亚碲酸钾溶液及羊血，混匀倾注平板。用法将标本直接接种于亚碲酸钾平板上。置35孵箱，经2448h培养，观察结果。白喉杆菌能使亚碲酸钾还原成金属碲而形成

23、黑色和灰黑色的菌落。二、革兰阴性杆菌分离培养基 (一)弧菌分离培养基 1.碱性琼脂用途用于霍乱弧菌分离培养。 配法蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，脂20g，蒸馏水1L。 将前4种成分混合于水中，加热溶解，校正pH至 8.4，分装后121灭菌15min，倾注平板。用法凡急性患有水样便标本做增菌培养的同时，应直接取标本接种到碱性琼脂平板或亚碲酸钾琼脂平板上。置35培养1216h，观察结果。霍乱弧菌生长较快，菌落大而扁平，呈青灰色，半透明，光滑湿润。在亚碲酸钾琼脂上菌落呈灰黑色。质量控制各实验室凡自配培养基或商品培养基,在使用前可用标准菌株生长对照，临床实验室可送防疫部门所设立的专门检验机构进

24、行目的菌监测,质量可靠者方可使用。EL-Tor弧菌生长良好；大肠埃希菌ATCC 25922 生长抑制。保存置4冰箱，1周内用完。2.碱性胆盐琼脂用途用于霍乱弧菌分离培养。配法蛋白胨10g，牛肉膏 5g，氯化纳5g10g，琼脂 20g，胆盐（牛、猪）2.5g，蒸馏水1L。将上述成分称量混合于水中加热溶解，校正pH至8.4，分装121灭菌15min，倾注平板。用法取粪便标本或增菌培养物1接种环接种平板，置35温箱培养1618h。霍乱弧菌迅速生长，其它细菌生长较缓慢。在1618h后，霍乱弧菌的菌落，直径可达2mm左右，呈扁平，青灰色，半透明，光滑湿润，易挑起。其它细菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。

25、质量控制同碱性琼脂。保存置冰箱，1周内用完。3.庆大霉素琼脂用途用于霍乱弧菌分离培养。配法蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，枸橼酸钠10g，无水亚硫酸钠3g，蔗糖(或白糖)10g，琼脂1520g，庆大霉素、多粘菌素B“双抗液”2ml，蒸馏水1L。 将上述成分(除“双抗液”外)称量混合于水中，加热溶解，校正pH至8.4，分装灭菌12115min，待冷却至50后，每100ml内加“双抗液”0.2ml，另加5g/L亚碲酸钾溶液0.1ml，再倾注平板。最后每毫升培养基内含有庆大霉素0.5U，多粘菌素B6U。用法将粪便标本或增菌培养物划线接种到该平板上，置35培养1618h。由于该培养基抑制性强，

26、其它非弧菌科细菌被抑制，而霍乱弧菌生长迅速，16h菌落可达2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑湿润。若培养时间长，菌落略黄色、隆起，中心厚而不透明。质量控制霍乱弧菌(小川、稻叶)生长良好，培养1824h菌落直径2.53.0mm；大肠埃希菌和变形杆菌生长抑制。保存置4冰箱内，1周内用完。注： 该培养基国内有商品出售，多数产品已加入庆大霉素，使用时，应详阅说明书。“双抗液”配制：98ml灭菌蒸馏水中加庆大霉素(25000U/ml)1ml,多粘菌B或抗敌E(300000U/ml)1ml。4冰箱保存，1月用完。4.四号琼脂用途用于霍乱弧菌分离培养。配法蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉浸膏3g，亚硫酸钠

27、(无水)3g，枸橼酸钠10g，猪胆汁粉5g，十二烷硫酸钠20g，利凡诺（雷佛奴尔）3g，琼脂粉12g，庆大霉素亚碲酸钾混合液 1ml，蒸馏水1L。将前8种成分放入玻璃或搪瓷容器内(严禁用铝制容器等金属容器)，加入蒸馏水，加热溶解混合后，调整至pH8.0,然后按1.2%加入琼脂，煮沸至琼脂溶化后，冷至60左右，按每100ml琼脂加入庆大霉素亚碲酸钾混合液(1ml 40000U庆大霉素加79ml蒸馏水混合后，加入0.8g亚碲酸钾溶解混合即成，每毫升含500U庆大霉素和10g/L亚碲酸钾)0.1ml，摇匀，倾注平板。用法取待检标本划线接种平板，置35培养过夜。 8h后即可初步观察结果。24h培养后，

28、霍乱弧菌呈中心黑色、较大而扁平的菌落。质量控制配成的培养基呈亮黄色透明；EL-Tor弧菌稻叶型生长良好；EL-Tor弧菌小川型生长良好；大肠埃希菌ATCC25922抑制生长。注： 庆大和亚碲酸钾混合液应新鲜配制并置冰箱保存。 雷佛奴尔应避光保存，而且每批均应预试后方可使用。成品培养基应避光保存。(二)肠杆菌分离培养基1.中国蓝琼脂用途分离肠道菌的弱选择性培养基。配法肉膏汤琼脂(pH7.4)1L，10g/L中国蓝溶液(灭菌)10ml，乳糖10g，10g/L蔷薇红酸乙醇溶液10ml。取乳糖10g置于已灭菌的肉膏汤琼脂瓶内，加热溶解琼脂并混匀。待冷却至50左右，加入中国蓝、蔷薇红酸乙醇溶液混匀，立即

29、倾注平板，凝固后备用。用法将标本接种平板，置351824h。分解乳糖产酸的细菌，其菌落呈蓝色；不分解乳糖的细菌，菌落为淡红色的透明菌落。质量控制大肠埃希菌ATCC 25922菌落呈蓝色；痢疾志贺菌型ATCC 13313和鼠伤寒沙门菌ATCC 13311菌落呈淡红色。保存4冰箱保存，1周内用完。注：(1)中国蓝溶液需煮沸或115灭菌15min后应用。蔷薇红酸乙醇溶液无需灭菌，但加热时应避开火焰。 (2)蔷薇红酸能抑制革兰阳性细菌生长，但对大肠埃希菌没有抑制作用，标本接种量不宜太多。(3)此培养基pH7.4，应呈淡红色。若过碱呈鲜红色，过酸则呈蓝色，均不适用。2.木糖、赖氨酸、去氧胆酸盐(XLD)

30、培养基用途为肠道菌选择性培养基。配法酵母浸膏3g,L-赖氨酸5g,氯化钠5g,D-木糖3.75g,乳糖7.5g,蔗糖7.5g,去氧胆酸钠2.5g,硫代硫酸钠6.8g,枸橼酸铁铵0.8g,琼脂13.5g,1%酚红溶液8ml,蒸馏水1L。将上述成分(酚红除外)混合，加热溶解，校正pH至7.2,再加入酚红溶液混匀。121高压灭菌15min，倾注平板备用。用法将标本划线接种平板，置35培养1824h。大肠埃希菌、肠杆菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属细菌可形成黄色、不透明菌落；大多数沙门菌属细菌因不利用糖类，为半透明红色或无色菌落。质量控制大肠埃希菌呈黄色菌落；宋内志贺菌呈无色菌落；伤寒沙门菌呈红色菌落有

31、黑心；金黄色葡萄球菌抑制生长。保存贮存于4有效期5天。3.SS琼脂用途沙门菌属和志贺菌属(Salmonella-Shigella)的分离培养。配法月示胨 5g，牛肉膏5g，乳糖10g，琼脂1520g，胆盐(No.3)3.5g，枸橼酸钠8.5g，硫代硫酸钠8.5g，枸橼酸铁1g，1% 中性红溶液2.5ml，0.1% 煌绿溶液0.33ml，蒸馏水1L。将上述成分(除中性红、煌绿外)混合于水中，加热煮沸溶解，校正pH至7.07.1，然后加入中性红和煌绿溶液，充分混匀冷却至50时倾注平板。用法将标本接种平板，置35培养1824h。沙门菌属菌落呈无色半透明，产生硫化氢者菌落中心呈黑色；志贺菌属的菌落呈无

32、色半透明；大肠菌属呈红色浑浊；宋内志贺菌能延缓发酵乳糖，培养24h后可以出现红色菌落。肠道致病菌的菌落直径均可达1.5mm以上。质量控制大肠埃希菌菌落呈红色；痢疾志贺型、福氏志贺菌和伤寒沙门菌生长良好，菌落无色；肠炎或猪霍乱沙门菌菌落呈黑色；粪肠球菌、金黄色葡萄球菌不生长。保存避光，3天内用完。注：煌绿要新配，中性红要优质。4.麦康凯琼脂用途麦康凯琼脂(Maconkey agar)用于肠道致病菌的分离培养和非发酵细菌鉴别。配法蛋白胨20g，氯化钠5g，胆盐(猪、牛、羊)5g，乳糖10g，琼脂1520g，1%中性红溶液5ml，蒸馏水1L。将上述成分(除中性红外)称量加入水中，加热溶解，校正pH至

33、7.2，加入中性红溶液，分装灭菌11520min，冷却至50左右时倾注平板。用法取标本或增菌培养物接种平板，置35培养1824h。不发酵乳糖的肠道细菌呈无色菌落，直径约2.0mm左右，光滑半透明。质量控制大肠埃希菌菌落呈桃红色；痢疾志贺菌菌落呈无色；伤寒沙门菌菌落无色；金黄色葡萄球菌不生长。保存置4冰箱(避光)，1周内用完。注：非发酵细菌在该平板上是否生长，是临床鉴定某些非发酵细菌的指标之一。5.伊红美蓝琼脂用途用于肠道致病菌及大肠菌群分离培养。配法蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，20g/L伊红Y溶液20ml，6.5g/L美蓝溶液10ml，琼脂17g，蒸馏水1L。将蛋白胨、磷酸盐、琼

34、脂称量混合于水中，并加热煮沸溶解，校正pH至 7.1，分装121灭菌15min备用。临用时加热溶化琼脂加入乳糖，冷至5055时加入伊红和美蓝溶液，摇匀倾注平板。用法取粪便标本或增菌培养物接种平板，置35培养1824h。根据检验目的不同，挑取无色菌落或挑选紫红色及有金属光泽的菌落转种克氏双糖或三糖铁琼脂进行鉴定。质量控制大肠埃希菌菌落呈紫红色，有时有金属光泽，直径2.3mm；伤寒沙门菌菌落呈灰白色，直径1.8mm；金黄色葡萄球菌不生长。保存置4冰箱，1周内用完。6.克氏双糖铁琼脂用途克氏双糖铁琼脂(Kliger iron agar)用于肠杆菌科细菌的初步鉴定。 配法蛋白胨20g,牛肉膏3g,酵母

35、膏3g,乳糖10g,葡萄糖1g,氯化钠50g,枸橼酸铁铵0.5g,硫代硫酸钠0.5g,0.2%酚红溶液5ml,琼脂12ml,蒸馏水1L。将前8种成分称量混合于水中，加热溶解，校正pH至7.5，再加入琼脂和酚红溶液，煮沸溶解分装试管，每管4ml，经115灭菌20min，立即制成高层斜面，待凝固后经无菌试验备用。用法取待检菌纯培养物，用接种针作底层穿刺和斜面划线接种，置35培养1824h，观察结果。斜面变黄，底层变黄，产气者或不产气者多属大肠埃希菌群及发酵乳糖的菌株。斜面变红，底层变黄，为不发酵乳糖菌株。产硫化氢菌株可使底层或全管产生黑色反应。质量控制奇异变形杆菌 K/A 硫化氢阳性；大肠埃希菌

36、A/A；志贺痢疾杆菌 K/A；伤寒沙门菌 K/A 硫化氢阳性；铜绿假单胞菌 K/K。保存置4冰箱，2周内用完。注:该培养基pH值尤为重要，pH7.5时使用效果最佳。7.三糖铁琼脂用途用于肠杆菌科细菌初步生化鉴定。配法蛋白胨15g，月示胨5g，牛肉膏3g，酵母膏3g，乳糖10g，蔗糖10g，葡萄糖1g，氯化钠5g硫酸亚铁2g/L，硫代硫酸钠0.3g，0.2%酚红溶液5ml，琼脂12g，蒸馏水1L。将前10种成分称量混合于水中，加热溶解后校正pH至7.4，再加琼脂及酚红溶液，加热煮沸溶解。分装试管，每管4ml，经115灭菌20min，立即置高层斜面，待凝固后，经无菌试验备用。用法取待检菌纯培养物，

37、用接种针作底层穿刺和斜面划线接种，置35培养1824h观察结果。发酵乳糖或蔗糖的菌可使斜面及底层均变黄色。不发酵乳糖和蔗糖的细菌仅发酵葡萄糖时使底层变黄，斜面变红。产生硫化氢的菌株可使底层或整个培养基呈黑色。分解乳糖或蔗糖后产气时有些菌株还能使培养基断裂。质量控制伤寒沙门菌K/A， 硫化氢阳性；副伤寒沙门菌K/A， 硫化氢阳性；痢疾志贺菌K/A；大肠埃希菌A/A；普通变形杆菌A/A， 硫化氢阳性；铜绿假单胞菌 K/K。保存置4冰箱，2周内用完。注：该培养基pH7.5时使用效果最佳。8.山梨醇麦康凯琼脂用途用于致病性、侵袭性和产毒性大肠埃希菌分离培养。配法蛋白胨5g，月示胨3g，氯化钠5g，胆盐

38、（猪、牛、羊）5g，山梨醇10g，琼脂粉12g，0.1g/L结晶紫溶液1ml，5g/L中性红溶液5ml，蒸馏水1L将前4种成分混合于水中，加热溶解，校正pH至7.2，再加入琼脂粉加热煮沸溶解。分装三角烧瓶100ml。经12115min灭菌备用。临用时，加热溶解，再加山梨醇、结晶紫及中性红溶液，摇匀倾注平板。用法将标本或增菌液接种平板，置35培养1824h。与麦康凯琼脂不同之处是挑取致病性大肠埃希菌菌落时，以无色菌落为主，同时兼取红色菌落，如EPEC迟缓分解山梨醇，菌落呈红色。EHEC O157H7菌落无色。质量控制参照麦康凯琼脂。保存置4冰箱，1周内用完。(三)非发酵细菌用培养基 1.金氏培养

39、基(甲)用途金氏培养基(Kings Medium)用于检测假单胞菌产生的青脓素。配法蛋白胨20g，无水氯化镁1.4g，无水硫酸钾10g，琼脂15g，甘油10ml，蒸馏水1L。将上述成分加热、溶解，调pH至7.2，分装试管，118121灭菌15min，制成斜面和高层备用。用法取待检菌划种于上述斜面上，35培养过夜。观察斜面上产色素情况。2.氧化-发酵试验培养基用途用于检测细菌代谢类型。配法（1）Hugh-Leifson培养基(革兰阴性杆菌用)：蛋白胨2g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾0.3g，氯化钠5g，溴麝香草酚蓝（BTB）0.03g，琼脂 2.5g，蒸馏水1L。（2）葡萄球菌O/F(葡萄球菌和微

40、球菌鉴别用)：胰蛋白胨10g，酵母浸膏10g，琼脂20g，溴甲酚紫0.001g，蒸馏水1L，葡萄糖10g。将上述成分混合加热溶解，调pH至7.1，分装于试管中，每支试管5ml，高压灭菌12115min，使成琼脂高层，备用。用法从斜面上挑取少许培养物，同时穿刺接种两支培养基，其中一支接种后，滴加液体石蜡于培养基表面，高度约1cm。置35孵箱培养2448h。培养基变黄表示细菌分解葡萄糖而产酸，颜色不变为不分解葡萄糖。质量控制金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC 25922发酵型；铜绿假单胞菌ATCC27853氧化型；易变微球菌、粪产碱杆菌不利用。注：(1)有些细菌不能在上述培养基上

41、生长，需在该培养基中加入2%血清或10g/L酵母浸膏，重做试验。(2)指示剂不能用乙醇配制，因有些细菌可使乙醇产酸，导致发酵或氧化反应影响结果判断。（四）其它革兰阴性杆菌用培养基1.军团菌培养基缓冲活性炭酵母琼脂培养基（BCYE）用途用于嗜肺军团菌的分离培养。配法酵母浸液10g，活性（NoritSG）2g，L-半胱氨酸盐酸盐0.4g，可溶性焦磷酸铁盐0.25g，琼脂17g，N-2-乙酰氨基-乙氨基乙醇磺酸（ACES）10g,蒸馏水80ml。上述成分除半胱氨酸及焦磷酸铁外，其余成分混合加热溶解，经12115min 灭菌，放水浴中冷却到50。另外分别配新鲜L-半胱氨酸溶液（10ml蒸馏水中含0.4

42、g）及焦磷酸铁溶液（10ml含0.25g），分别过滤除菌，再加入已灭菌琼脂中，加入1mol/L 氢氧化钾溶液45ml使培养基的最终pH为6.97.0，可用1mol/L 盐酸溶液校正，倾注平板，冷却后置4冰箱备用，亦可制成斜面，用于保存菌种。该培养基为黑色。用法液体标本可直接接种培养基，肺、肝、脾等固体标本须制成100g/L悬液后再接种培养基，接种后的培养基置35需氧环境培养，培养箱需保持一定的湿度。每天用解剖镜检查平板培养物，用略大于100角的斜射光源照明。在BCYE平板上，培养45 天，菌落直径约12mm，并出现亮蓝和切削玻璃样的构造；继续培养后菌落增大呈黄绿色，较光滑。保存在室温、暗室中可

43、保存1周2.弯曲菌选择性培养基（1）Skirrows培养基用途用于空弯及幽门螺杆菌分离培养。配法蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂粉12g，万古霉素10ml，多粘菌素B 2500U，TMP 5mg，脱纤维羊血70ml，蒸馏水930ml。除血和抗生素外，其余成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.2，121灭菌15min。待冷至50时加入羊血7ml和多抗液0.5ml，摇匀，倾注无菌平板。用法将标本接种平板，置25或43微需氧环境中培养48h，菌落直径达12mm，为不溶血的菌落。质量控制大肠埃希菌ATCC 25922和粪肠球菌ATCC33186不生长；空肠弯曲菌胎儿亚种ATCC

44、29424生长良好。注：1）多抗液的配制：乳酸62mg(约2滴)加入100ml灭菌水中，然后加入TMP100 mg，混合加热100灭菌。取液5ml，再加万古霉素100mg和多粘菌素B 0.38mg，摇匀后即可。2）弯曲菌属系微需氧菌，培养时可提供5%氧气及10% 二氧化碳。高浓度氧不利于细菌生长，尤其是幽门螺杆菌。因此标本采集后，应尽快接种培养，或置运送培养基中运送。3）弯曲菌运送可用布氏菌汤培养基。Campy-BAP培养基用途用于分离培养弯曲菌。配法蛋白胨10g，胰胨10g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，氯化钠5g，重亚硫酸钠0.1g，蒸馏水900ml，脱纤维羊血100ml，万古霉素10mg，

45、多粘菌素B 2500U，TMP5mg，两性霉素B 2mg。将上述成分（除羊血和抗菌补充剂外），加入900ml蒸馏水，加热溶解，调pH至7.2后分装，121灭菌15min，加入羊血和抗菌药物添加剂，充分混匀后倾注于无菌平皿内。用法取标本接种于平板，置25或43微需氧环境中培养48h，菌落直径达12 mm，不溶血。质量控制大肠埃希菌ATCC 25922不生长；粪肠球菌ATCC 33186不生长；空肠弯曲菌胎儿亚种ATCC 29424生长良好。第五节生化试验培养基一、糖发酵试验培养基1.糖醇发酵试验培养基用途检查细菌对不同糖(醇)类的发酵能力，达到鉴定细菌的目的。配法蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠

46、 5g，安德烈(Andrade)指示剂10ml，蒸馏水1L，各种糖(醇)类 510g。将上述成分混合后，加热溶解。矫正pH至7.2。根据需要，分别再加相应的糖和醇。分装于13mm×100mm的试管，每管约3ml，115灭菌15min。如需观察产气，可在试管内加小倒管1只。将分离的纯菌接种到糖（醇）发酵管中，置35培养1824h。接种菌若能分解培养基中的糖（醇）类而生成酸，使指示剂呈酸性反应，若产生气体，则可使液体培养基中的倒管(Durham管)内出现气泡；若接种菌不分解糖（醇）则无反应。2.血清菊糖试验培养基用途用于肺炎链球菌与其它链球菌鉴别。配法血清(兔血清或牛血清)25ml，1g

47、/L酚红溶液2ml，菊糖1g，蒸馏水75ml。先取血清25ml、蒸馏水75ml混合，置阿诺灭菌器内加热15min，以破坏血清内的淀粉酶。调pH至7.4，然后加入菊糖1.0g、1g/L酚红溶液2ml摇匀。分装于13mm×100mm的试管，每管2ml。用间歇灭菌法灭菌，每天1次，连续3天，每次20min。用法将被检菌接种培养基，置35培养1824h。分解菊糖的菌株使培养基变黄；不分解菊糖的菌株，培养基不变色。质量控制肺炎链球菌ATCC 10015阳性；化脓性链球菌ATCC 19615阴性。3.胆汁七叶苷试验培养基配法蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，牛胆汁40g，七叶苷1g，枸橼酸铁0.5g，琼

48、脂15g，蒸馏水1L。将上述成分混合加热溶解，调pH至7.2，分装试管，115灭菌15min。将待测菌种接种到七叶苷培养基的斜面上，置35孵育1824h，观察结果。培养基变为黑色或棕色者为阳性；不变色者为阴性。质量控制粪肠球菌 ATCC29212 阳性；化脓性链球菌ATCC19615 阴性。保存置4冰箱，2周内用完。二、酶类测定培养基和试剂1.氨基酸脱羧酶试验培养基用途检查细菌使氨基酸脱羧基形成胺使培养基变碱的能力。常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。配法蛋白胨5g,牛肉浸膏5g,溴甲酚紫0.1g,甲酚红0.005g,吡多醛(VB6)0.005g,葡萄糖0.5g,蒸馏水1L。加热慢慢溶解，按

49、10g/L浓度加入所需要的氨基酸，调pH至6.0，呈深亮紫色。分装每支2ml，同时配对照管(不加氨基酸)，高压灭菌12115min,冷却后4冷藏备用。用法将试验菌接种培养基，同时接种对照管1支。并用灭菌的液体石蜡覆盖，置35培养1824h。阳性菌初期由于细菌发酵葡萄糖产酸呈黄色，若继续孵育，氨基酸经脱羧产生胺类使培养基变碱，指示剂改变颜色，呈紫色或紫红色。阴性呈黄色或不变色。质量控制赖氨酸脱羧酶:迟缓爱德华菌阳性，弗劳地枸橼酸菌阴性；鸟氨酸脱羧酶:产气肠杆菌阳性，弗劳地枸橼酸菌阴性;精氨酸脱羧酶:鼠伤寒沙门菌阳性，普通变形杆菌阴性。2.耐热DNA酶培养基用途用于检测细菌所产生的耐热脱氧核糖核酸

50、酶。配法胰蛋白胨1.5g,植物蛋白胨0.5g,氯化钠0.5g,DNA 2g/L,琼脂1.5g,蒸馏水100ml,2g/L甲苯胺蓝溶液 0.25ml。将前6种成分徐徐加热溶解后，调pH至7.4，加入甲苯胺蓝溶液，分装试管， 121灭菌15min后备用。用法上述琼脂倾注于载玻片上，凝固后，打孔，孔径2cm，孔内加入经10015min隔水加热处理后的肉汤培养物。将载玻片孵育于35湿盒内4h,取出观察结果。阳性反应在孔周围出现不小于4mm直径粉红色圈，阴性反应培养基的颜色无改变。质量控制金黄色葡萄球ATCC 25923 阳性；表皮葡萄球菌ATCC 12990 阴性。3.DNA酶试验培养基用途供细菌DN

51、A酶测定用。配法DNA2g，胰酪胨15g，大豆胨5g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L。将5种成分混合于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.27.4，分装三角烧瓶，经115灭菌15min，倾注灭菌平皿，4冷藏备用。用法将待检菌作点状穿种在平板上，置35培养24h。待细菌生长成集落菌苔后，在其菌苔上及周围滴加0.1mol/L盐酸溶液数毫升，待片刻后，如待检菌DNA酶阳性，可在菌苔的周围出现明显的透明圈；而阴性者则无透明圈出现。质量控制金黄色葡萄球菌ATCC 25923和粘质沙雷菌 ATCC 274阳性;表皮葡萄球菌ATCC 14990和大肠埃希菌ATCC 25922阴性。保存置4冰箱1周内用完。

52、4.氧化酶试验用途区别假单胞菌与氧化酶阴性的肠杆菌科细菌。配法盐酸二甲基对苯二胺（或四甲基对苯二胺）0.1g加蒸馏水10ml。用法取白色洁净滤纸一角，沾取试验菌落少许，加试剂一滴。阳性者立即显粉红色，并于510s内呈现深紫色反应。若用四甲基对苯二胺则阳性为蓝色。质量控制铜绿假单胞菌ATCC27853阳性；大肠埃希菌ATCC25922阴性。保存置棕色瓶内可用一周，4冰箱保存，或分装于棕色瓶内密封。5.尿素酶试验培养基用途用于细菌尿素酶测定。配法蛋白胨1g,葡萄糖1g,氯化钠5g,磷酸二氢钾2g,4g/L酚红溶液3ml,琼脂1820g,200/L尿素溶液100ml,蒸馏水1L。将前5种成分混合于蒸

53、馏水中，加热溶解，校正pH至7.0，然后加入酚红溶液，分装每瓶100ml，经121灭菌15min备用。临用时，加热溶解，冷却至55左右，加入无菌的尿素溶液10ml，摇匀立即无菌分装于灭菌试管，每支2ml，并置成斜面。经无菌试验后备用。用法取培养物接种斜面，35孵育24h。尿素酶阳性者斜面变红色,阴性者颜色无变化。质量控制普通变形杆菌ATCC 13315(8h)整个培养基变红、肺炎克雷伯菌ATCC 27236仅斜面变红(24h)；大肠埃希菌ATCC 25922为阴性(24h)。保存置4冰箱，2周内用完。6.磷酸酶试验培养基用途测定细菌产生磷酸酶的能力。用于区别葡萄球菌有无致病性，致病性葡萄球菌呈阳性。还有助于克雷伯菌属与肠杆菌属的鉴定。配法含磷酸酚酞的营养琼脂培养基。将上述琼脂加热溶化，待冷却至45时，加入滤过除菌的10g/L磷酸酚酞溶液1ml，摇匀后倾注平板。用法接种待测菌株，35培养1824h。在平皿盖上滴加浓氨水1滴，熏蒸片刻。如有酚酞释出，菌落即变为粉红色为阳性；不变色为阴性。注： 亦可用液体法进行试验：经培养后在培养基内滴加氢氧化钠溶液，观察结果，显红色为阳性。 以上为酸性磷酸酶的试验方法。如果作碱性磷酸酶试验，可将磷酸对硝基酚加入pH10.5、0.04mol/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲液内。观察结果时不必另行加碱。 酚酞指示剂产生的颜色随其pH而变化，试剂的量要准