微生物限检查实验

1、微生物限度检查检验任务:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门菌的检测一、实验目的1.熟悉药品中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的检验原理。 2.熟悉检验金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的程序与方法。二、实验材料1、培养基和稀释液：亚碲酸钠肉汤（或亚碲酸钠北沙参胨水培养基）、卵黄高盐琼脂（或血平板或TMP高盐琼脂）、营养琼脂斜面培养基、甘露醇发酵管、胆盐乳糖增菌液、十六烷三甲基溴化铵培养基、绿脓色素测定用培养基（PDP琼脂）、硝酸盐胨水平板（DHL）、明胶液化培养基，营养琼脂培养基、四六磺酸钠绿亮培养基（TYB増菌液）、胆盐硫乳琼脂、沙门、志贺菌属培养基（SS）、曙红亚甲蓝琼脂（EMB）、

2、麦康凯琼脂（MacC）、三糖铁琼脂培养（TSI培养基）、脲琼脂培养基、半固体营养琼脂培养基、0.9%无菌氯化钠溶液-蛋白胨缓冲液。2、器皿灭菌锥形瓶（50ml）、灭菌培养皿、刻度吸管试剂（已配好）：1%二甲基对苯二胺盐试液、氯仿、IN盐酸、NS第一次 培养基的配制1.培养基及稀释液：0.9%无菌氯化钠溶液-蛋白胨缓冲液配方：氯化钠4.3g 蛋白胨1.0g 磷酸二氢钾3.5g 磷酸氢二钾7.23g 水1000ml亚碲酸钠肉汤：90ml/瓶*3瓶卵黄高盐琼脂培养基（或TMB培养基或血琼脂平板）：3个*20ml/个营养琼脂斜面：3个平皿*约20ml/个甘露醇发酵管：3支*5ml/支TYB増菌液：90

3、ml/瓶*3胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂）：20ml/个*3个麦康凯琼脂培养基（或曙红亚甲蓝琼脂培养基）：20ml/个*3三糖铁琼脂斜面培养基：5ml/支*3支脲琼脂培养基斜面：5ml/支*3支半固体营养琼脂培养基：5ml/支*3支胆盐乳糖增菌液（BL増菌液）：90ml/瓶*3瓶十六烷三甲基溴化铵平板：6个*20ml/个PDP琼脂斜面：3支*5ml/支硝酸盐胨水培养基：3支*5ml/支明胶培养基：5ml/支*3支第二次 供试液及増菌液的制备供试液的制备取供试液10ml，加入Ph7.0无菌氯化钠溶液-蛋白胨缓冲液90ml，混匀，制成1：10供试液。稀释倾注培养基将供试液倾注入已加稀

4、释液的无菌平板，每个稀释度注2个平皿，每个平皿约15-20ml，将供试液和培养基混匀，放置，待凝。取亚碲酸钠肉汤（或亚碲酸钠北沙参胨水培养基）3份，每份100ml，分别加入10ml供试液，10ml供试液及0.2ml对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于37环境下培养24-48h。取四六磺酸钠绿亮培养基（TYB増菌液）3份，每份100ml，分别加入10ml供试液，10ml供试液及0.2ml对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于 环境下培养 取胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂）3份，每份100ml，分别加入10ml供试液，10ml供试液及0.2

5、ml对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于37环境下培养18-24h第三次 分离培养将上述各种供试品培养液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线至下类各种培养基培养基种类细菌种类卵黄高盐琼脂培养基（或TMB培养基或血琼脂平板）金黄色葡萄球菌十六烷三甲基溴化铵平板绿脓杆菌胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂）沙门氏菌麦康凯琼脂培养基（或曙红亚甲蓝琼脂培养基）沙门氏菌置于37，培养1824h第四次 金黄色葡萄球菌：取金黄色葡萄球菌纯培养物，接种于甘露醇发酵管中，置于37C培养1824h。【金黄色葡萄球菌发酵甘露醇产酸使培养基变成黄色（溴麝香草酚蓝在酸性条件下呈黄色）】。

6、绿脓杆菌：绿脓色素试验与硝酸盐还原试验挑取分离的纯培养物分别接种于PDP琼脂斜面，硝酸盐胨水培养基中，置37培养24h。明胶液化试验用接种针取疑似绿脓杆菌菌落，穿刺接种于明胶培养基内，置37培养24h。42生长试验挑取纯培养物，接种在营养琼脂斜面培养基上，置42水浴中培养2448h，沙门氏菌：脲酶试验：取菌种接种于脲琼脂培养基斜面，置于37培养1824h 动力试验：穿刺接种于半固体营养琼脂培养基，置于37培养1824h第五次 生化实验和镜检、表格填写1.生化实验金黄色葡萄球菌：（1）.甘露醇发酵试验若发酵甘露醇产酸使培养基变成黄色（溴麝香草酚蓝在酸性条件下呈黄色）。则证明有金黄色葡萄球菌（2）

7、.血浆凝固酶试验.玻片法 取一洁净干燥的载玻片在两边分别滴加NS和血浆各一滴，用接种环取待检菌分别在NS和血浆滴中充分研磨混合，观察反应现象。凡在5min内混箘的血浆出现团块或颗粒状凝块，为血浆凝固酶试验阳性。而混菌的生理盐水仍呈均匀浑浊状。若混菌后的血浆和生理盐水仍都呈均匀浑浊状者，其结果为阴性。.试管法取无菌小试管2支，用无菌吸管吸取血浆原液或1：1盐水血浆稀释液加入试管中，每管各0.5ml，然后用无菌吸管吸取待检肉汤培养物0.5ml,然后用无菌吸管吸取待检肉汤培养基0.5ml，或用接种环直接取斜面培养基上的菌苔，与其中一支血浆试管中的血浆充分混和，另一支试管不加菌作对照。将2支小试管同时

8、放在37C温箱内保温3h后开始检查，若加菌的血浆试管中24h内出现凝固现象，不加菌的血浆试管血浆仍呈液体状，为血浆凝固酶试验阳性，若两者均无凝固现象，则为阴性。绿脓杆菌：（1）氧化酶试验具有氧化酶的细菌能将二甲基对苯二胺氧化，使试剂中的氢脱出与氧结合，试剂则被氧化成红色的醌类化合物。取一小块白色洁净的滤纸片放在平皿内，用无菌玻璃棒挑取疑似绿脓杆菌菌落涂在滤纸片上，再滴加新配制的1%二甲基对苯二胺盐酸盐试液一滴。在30s之内，纸片上的待检物如出现粉红色，并逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性。如待检物不变色，则为阴性。注意事项：铁等金属能催化二甲基对苯二胺液呈红色，故不宜用接种环取菌苔，可用玻璃棒

9、或干净火柴杆取菌； 在滤纸上滴加试剂以刚湿润为宜，如太湿则阻碍空气与菌苔接触，使呈色时间延长，造成假阴性； 二甲基对苯二胺盐酸盐试液容易氧化，应装在棕色瓶中，置冰箱保存，如变红色则不宜使用。（2）绿脓色素试验在试管内加氯仿3-5ml，搅碎培养基并充分振摇，将琼脂斜面培养物产生的色素提取在氯仿中。待氯仿提取液呈蓝绿色时，用滴管将其移至另一试管中，然后加入1ml1mol/L盐酸溶液，振摇后静置片刻，如在上层的盐酸溶液内出现粉红色，即为阳性，证明被检菌的培养物中有绿脓色素。（3）硝酸盐还原试验观察反应结果，如该菌还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气，培养液中的杜氏小倒管内就会出现气泡，该实验结果为阳

10、性。（4）明胶液化试验如穿刺局部呈液化状态，取出放冰箱内冷藏1030min，仍呈溶液状，则明胶液化试验为阳性。（5）42生长试验观察生长状况，有菌苔生长者为阳性。沙门氏菌：靛基质试验：脲酶试验：观察现象，加入酚红指示剂后呈红色为阳性氰化钾试验：赖氨酸脱羧酶试验：紫色或紫红色：阳性，黄色：阴性动力试验：有鞭毛能运动：有沙门菌血清凝集试验：用可疑菌作为抗原，沙门菌AF“O”多价血清作为抗体进行玻片凝集反应，并以生理盐水做对照试验。试验检测出凝集现象表明可能是沙门氏菌，若凝集试验为阴性，则可将菌液于100水浴保温30min后再做凝集试验2.镜检取纯培养物，涂片，革兰色染色，显微镜油镜下观察结晶紫（1min）-碘液（1min）-酒精（30min）-复红3.表格填写 药品微生物限度检查试验记录检品编号： 室温： 湿度：检品名称 规格批号包装效期生产单位检品数量供样单位収验日期检验目的检验日期检验依据报告日期供试液制备：1.常规法 供试品 g（ml）Ph7.0无菌氯化钠-蛋白