实验-两对半的检测ppt课件

1、 ELISA ELISA检测检测“乙肝二对半乙肝二对半 (Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA) (Enzyme linked immunosorbent Assay ELISA) 1酶免酶免疫技疫技术分术分类类 酶免疫组化酶免疫组化 酶免疫测定酶免疫测定 固固相相酶酶免免疫疫测测定定 液液相相酶酶免免疫疫测测定定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定2ELISAELISA的概念的概念酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验 enzyme-linked immunosorbent assayenzyme-linked immunosorb

2、ent assay，ELISAELISA酶联：抗原或抗体的酶标志。酶联：抗原或抗体的酶标志。免疫：以抗原抗体特异性反响为根底。免疫：以抗原抗体特异性反响为根底。吸附：抗原或抗体包被于固相载体外表。吸附：抗原或抗体包被于固相载体外表。 在固相载体外表实现抗原抗体的反响，经过酶标志的手段，酶催化底在固相载体外表实现抗原抗体的反响，经过酶标志的手段，酶催化底物构成水解、氧化或复原反响，构成有色物质，其颜色的深浅与标本中的物构成水解、氧化或复原反响，构成有色物质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体的量直接相关。抗原或抗体的量直接相关。3ELISAELISA技术特点技术特点具有良好的灵敏度和特异性，能满足

3、临床需求，运用广泛。具有良好的灵敏度和特异性，能满足临床需求，运用广泛。操作简单、无需昂贵的仪器投入，价钱廉价。操作简单、无需昂贵的仪器投入，价钱廉价。对环境几乎没有污染。对环境几乎没有污染。4ELISAELISA技术的运用技术的运用检测抗原的方法：双抗体夹心法竞争法检测抗体的方法：双抗原夹心法间接法竞争法捕获法5实验目的实验目的掌握掌握ELISAELISA法检测法检测“乙肝二对半乙肝二对半 的原理、操作步骤及本卷须知。的原理、操作步骤及本卷须知。掌握检测掌握检测“乙肝二对半的临床意义。乙肝二对半的临床意义。 6什么是什么是“乙肝二对半？乙肝二对半？“乙肝两对半是指：外表抗原乙肝两对半是指：外

4、表抗原HBsAg、外表抗体、外表抗体HBsAb、e抗原抗原 HBeAg 、e抗抗体体HBeAb、中心抗体、中心抗体HBcAbHBsAg本身不具有传染性，只具有抗原性本身不具有传染性，只具有抗原性维护性抗体：维护性抗体： HBsAb传染性目的：传染性目的： HBeAg ， HBcAgHBeAb， HBcAb不是维护性抗体，而是反映曾被不是维护性抗体，而是反映曾被HBV感染的重要目的。感染的重要目的。7为什么不检测中心抗原HBcAgHBcAgHBcAg主要位于病毒颗粒中，只需少数游离。主要位于病毒颗粒中，只需少数游离。机体免疫系统对机体免疫系统对HBcAgHBcAg很敏感，易产生高滴度的很敏感，易

5、产生高滴度的HBcAb,HBcAb,与与HBcAg HBcAg 构成免疫复合物。构成免疫复合物。血清中，血清中， HBcAg HBcAg可丧失部分氨基酸。可丧失部分氨基酸。8“乙肝二对半的检测原理乙肝二对半的检测原理HBsAgHBsAg：双抗体夹心法：双抗体夹心法HBsAbHBsAb：双抗原夹心法：双抗原夹心法HBeAgHBeAg：双抗体夹心法：双抗体夹心法HBeAbHBeAb：中和竞争法血清中的：中和竞争法血清中的e e抗体与固相抗体与固相e e抗体竞争结合抗体竞争结合e e抗原抗原HBcAbHBcAb：竞争抑制法：竞争抑制法9双抗原体夹心法测抗体原包被抗原包被抗原酶标抗原酶标抗原待测抗体待

6、测抗体包被抗体包被抗体酶标抗体酶标抗体待测抗原待测抗原Anti-HIV, Anti-HBs双抗体夹心法双抗体夹心法双抗原夹心法双抗原夹心法HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS210洗涤洗涤双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+ +- -Y YY YY YE EY YE EY YE EY YY YE EY YE EY YE EY YY YY YY YE EY YE EY YE EY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y Y YY YY Y11竞争抑制法测抗体 包被抗原包被抗原待测抗体待测抗体*酶标抗体酶

7、标抗体 Anti-HBcAnti-HBe12中和竞争法测抗体包被抗体包被抗体中和抗原中和抗原待测抗体待测抗体酶标抗体酶标抗体Anti-HBe13试剂盒组成包被反响板：固相的抗原或抗体包被反响板：固相的抗原或抗体酶结合物：酶标志的抗原或抗体酶结合物：酶标志的抗原或抗体显色剂：分显色剂：分A A、B B二瓶二瓶终止液终止液对照：阳性对照，阴性对照对照：阳性对照，阴性对照浓缩洗涤液浓缩洗涤液 中和试剂只需检测中和试剂只需检测HBeAbHBeAb的试剂盒才有的试剂盒才有14实验预备配制洗涤液：用蒸馏水按配制洗涤液：用蒸馏水按1 1：2020稀释浓缩洗涤液。稀释浓缩洗涤液。为节省实验时间，除检测中心抗体

8、为节省实验时间，除检测中心抗体HBcAbHBcAb组外，其他组可在加样后的温育时间中组外，其他组可在加样后的温育时间中才配制洗涤液。才配制洗涤液。15实验操作实验操作1、加样：第一、二孔为阴、阳对照孔，分别参与阴、阳对照50ul。其他各孔为样品孔，各参与待测标本50ul检测HBcAb 时，待测标本需用稀释后的洗涤液做1：30稀释。2、加中和试剂只需检测HBeAb时才需求：每孔50ul3、加酶结合物：每孔50ul4、温育：封板充分混匀后置37C水浴30分钟5、洗涤：弃去反响条孔内液体，用洗涤液注満每孔，放置或振荡1分钟，弃去拍干反复5次留意：最后一次一定要拍干6、显色：每孔先加显色剂A 50ul

9、，再加显色剂B 50ul，混匀后置37C水浴10分钟7、中止显色：每孔参与中止液50ul8、判别结果：16目测法：目测法：反应孔反应孔颜色颜色结果结果阴性对照阴性对照透明无色透明无色阴性阴性阳性对照阳性对照黄色黄色阳性阳性样品样品黄色黄色？样品样品浅黄色浅黄色？样品样品透明无色透明无色？HBsAg， HBsAb， HBeAg 17HBeAb ， HBcAb反应孔反应孔颜色颜色结果结果阴性对照阴性对照黄色黄色阴性阴性阳性对照阳性对照透明无色透明无色阳性阳性样品样品黄色黄色？样品样品浅黄色浅黄色？样品样品透明无色透明无色？18比色法：波长比色法：波长450nm读取各孔读取各孔OD值值HBsAg，

10、HBsAb， HBeAg 样品样品OD值值/阴性对照阴性对照OD值值2.1 HBeAb ， HBcAb阴性对照阴性对照OD值值/样品样品OD值值2.1建议双波长比色建议双波长比色450/630nm；临界值确实定请参考实验指点，不同的试剂盒；临界值确实定请参考实验指点，不同的试剂盒和检测原理，临界值的设定均不同和检测原理，临界值的设定均不同阳性阳性阳性阳性19ELISA的本卷须知标本：内源性标本：内源性RFRF、补体、嗜异性抗体等、补体、嗜异性抗体等 外源性要素溶血、细菌污染、保管不当、凝集不全、防腐剂外源性要素溶血、细菌污染、保管不当、凝集不全、防腐剂NaN3NaN3等等P229P229试剂：

11、试剂质量、批号、能否失效冰箱温度、平衡试剂：试剂质量、批号、能否失效冰箱温度、平衡3737度度C30C30分钟、摇匀分钟、摇匀加样：加样准确、不可太快，防止加在上部和产生气泡。加样：加样准确、不可太快，防止加在上部和产生气泡。温育：温度定期察看与登记、时间、湿度、封片不可反复用温育：温度定期察看与登记、时间、湿度、封片不可反复用洗板：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要点头。洗板：洗涤液用蒸馏水或去离子水现配、防止洗板机堵塞、洗完要点头。显色：加试剂时不可反复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止。显色：加试剂时不可反复加和漏加，或加在两孔之间，不要产生气泡，及时终止

12、。比色：建议用双波长可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响。比色：建议用双波长可排除标本浓度、干扰色、电路干扰、板底部划痕的影响。结果断定：反响终止后结果断定：反响终止后1010分钟内分钟内质量控制：内对照、室内质控、室间质评等全程质控认识质量控制：内对照、室内质控、室间质评等全程质控认识外表抗原阳性结果、灰区标本、矛盾结果或少见方式均须复查外表抗原阳性结果、灰区标本、矛盾结果或少见方式均须复查生物平安：试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处置。生物平安：试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处置。20常见的检测方式临床意义2模式模式 HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb 临床意义临床意义 1+-+-+急肝、慢肝活动期、有传染性急肝、慢肝活动期、有传染性2+-+急肝、慢性急肝、慢性HBsAg携带者携带者 3+-+急性急性HBV感染趋向恢复、感染趋向恢复、 慢性慢性HBsAg携带者、传染性弱携带者、传染性弱 4-+既往感染、急性既往感染、急性HBV感染恢复期、低感染恢复期、低含量携带者