时间分辨荧光质量控制及常见影响因素分析

1、时间分辨荧光时间分辨荧光质量控制及常见影响因素分析质量控制及常见影响因素分析 大同市第五医院检验科-王跃平是以采用稀土离子标记抗原或抗体、利用发光信号的强弱可对待分析物进行定量的检测，其灵敏度可以达到10-18mol/孔。分离特异性及非特异性荧光分离特异性及非特异性荧光,零背景零背景,高高特异性特异性灵敏度高灵敏度高、线性范围、线性范围宽宽、重复性、重复性好好 零本底、灵敏度高线性范围宽试剂有效期长试剂价格标准曲线稳定性好自动化高非开放性试剂系统、试剂价格过高。 标记差异标记差异污染污染免疫检测分析质量控制免疫检测分析质量控制 1 、方法标准化（）实验方法分类决定性方法准确度高，系统误差小，测

2、值接近真值。用途：标准品检测；参考方法评价 ( 一般不用于常规工作 )参考方法被决定性方法证实干扰因素少，测量结果可靠。用途：鉴定常规方法；质控品定值 ( 有条件实验室可用于常规工作 )常规方法有足够的精密度、准确性、特异性和适当分析范围。用途：经方法评估和学术组织认可后推荐为常规方法。例如： HBsAg 定量决定性方法紫外分光光度计测定蛋白参考方法高标记率固相放免常规方法酶标（）实验方法选择原则实用性：速度快、标本用量少、操作简便、安全可行。可信性：精密度、准确度、敏感性、特异性均达到要求。（）方法的评估敏感性特异性诊断指数诊断效率阳性预测值阴性预测值2 、试剂标准化（）分级 WHO 国际标

3、准品 WHO 国际参考品国家标准品按国际标准品复制的标准品，效力单位与严格一致。研究室或厂家标准品暂时用于工作的标准品，自行效价，但有国际标准品后，必须标化。免疫学质控标准品和参考品一般用国际标准品或国际参考品标化的用于质控的物质。（）免疫常用国际标准品和参考品免疫学检验质控常用国际标准品和参考品三、常用免疫质控1 、质控一般要求（）标本收集及处理每种标本有一定收集要求，应与临床医生、负责取血者及运送标本者交代清楚以便配合。有些标本要求特殊，应特别注意，例如测补体标本不能存于室温或 4 活化影响检测。 HBeAg 不能反复冻融，破坏蛋白。（）仪器的校准与标定 在免疫检测中酶标仪是最常使用的仪器

4、，仪器的校准一定要定时进行（一般使用频繁不超过半年，一般使用不超过一年）。校准应在仪器购买时请厂家对性能光路等校准并给出参数。此时，应做功能校准，选取定值校准品（含不同滴度及阴、阳标本） 4-5 天检测。其中对实验影响较大的加样器及水浴用温度计均应进行计量校准后使用，前者可采用称重法校准，后者可到国家计量单位进行。（）对照及质控品对照（一般指阴、阳对照）最好使用与被测样品同类物质。质控品一般可来自质控控制单位（如：各级临检中心），必要时可自制，但最好应与有溯源性标准物质进行比对。定量者可制作标准曲线。自身抗体等可使用国际通用阳性对照血清。质控品一般应包括高、中、低三种滴度。2 、免疫方法实验的

5、质控（）实验前特别要注意标本要求不溶血、无乳糜，并注意贮存温度。仪器应做好校准和标定。其免疫分析仪在购买时应注意到厂家提供的光路校准及技术要求，（注意最好无漂移）。安装后要进行功能校准。定性校准选阴性，高、中、低值阳性血清各 2 份连续进行 5天检测。定量校准在 96 孔板上选 20 处，随机测定，结果与标定值比较应在 2SD 内。加样器应定期校准。水浴箱除对温度计校准外，每次实验时温度计均应复测。（）实验中 按校准程序操作，不得随意减省操作步骤。质控分为室内和室间质控。一般室内质控应据工作量多寡决定间隔时间。质控物质可购买或自己标定，但要注意应有高、中、低值阳性质控品及阴性质控品。一定要设立

6、低值者。除定期开展质控外，在实验不稳定时要及时做。特别注意要每月做图总结。对失控应有记录并分析原因提出处理意见。在判断失控上可使用 Westgard 规则，特别要注意以下几种情况。： l 2S ：一质控点在 2S 之外应警惕。： R 4S ：连续 2 个质控点相差 4S 。： 4 1S ：连续 4 个质控点落同侧 1S 之外。： X ：连续 7 个质控点落均值一侧。： 7 ：连续 7 个质控点均或同一周期变化。（）实验后质控时还应注意收集临床资料，随时调整。（）开展质控特别应注意的几个问题试剂盒内阴、阳对照与质控不完全相等临界值质控品是保证实验质量的关键。作用：控制灵敏度，可测试剂盒灵敏度是否

7、达标。：控制精密度，连测 20 次，可获得均值 和标准差 SD 。做质控图，控制室内精密度。室内质控不合格的失控处理：停止发放报告。：查找原因：质控品是否有效，试剂、仪器及操作等，必要时重校准仪器，做试剂比对。重新合格后报告负责人方能发出报告。关于室间质控：如部、市均未开展室间质评的试验应定时比对 )： 80 以下得分应找原因及时纠偏。为什么要设置质控规则？为什么要设置质控规则？1.及时发现检测系统问题2.能初步分析和找出失控原因3.能不断的缩小CV（或）总误差分析前的质量控制是关键1、人员培训 操作人员必须具备一定的技术知识和经验，掌握免疫学的基本知识和原理2、标本采集、标本前处理因素分析前

8、质量控制（分析前质量控制（1）实验室环境、设施和设备 1、充分合理的空间、良好的照明、空调及湿度维持设备 2、仪器设备应保养良好。定期维护保养、年度校准、方法性能验证？分析前的质量控制（分析前的质量控制（2）理想的测定试剂和方法 1、质量好的数据 2、标准的操作程序（SOP） 3、试剂的储存（温度记录和失控处理，温度计）标本采集、标本前处理因素标本采集、标本前处理因素1、标本凝固不全（凝集血）2、标本管中添加物质的影响3、纤维凝块（促凝剂或抗凝血）4、纤维蛋白（促凝剂或抗凝血）标本凝固不全标本凝固不全干扰与对策干扰与对策血液通常30min开始凝固，1824h完全凝固。日常检验时血液还没完全凝固

9、就分离血清，此时分离出来的血清中残留部分纤维蛋白原，检测结果易造成假阳性次日复查时因血凝已完全，血清中不再具有纤维蛋白存在，故复查结果变为阴性对策：血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清标本管中添加物标本管中添加物-干扰与对策干扰与对策 酶抑制剂（如叠氮化钠（NaN3）可抑制辣根过氧化物酶活性）及快速分离的分离胶等均对免疫测定有一定干扰作用 如果在检测中，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应的措施排除干扰作用纤维凝块纤维凝块-干扰干扰纤维纤维凝块是由于离心前血清凝固不完凝块是由于离心前血清凝固不完全所致全所致如果纤维蛋白凝块随标本分配到试管如果纤维蛋白凝块随标本分配到试管中，血凝块

10、产生大量的微颗粒物质和中，血凝块产生大量的微颗粒物质和具有细胞凋亡（具有细胞凋亡（AP）活性的物质）活性的物质细胞凋亡细胞凋亡（AP）活性的物质在酶反应）活性的物质在酶反应会产生测试信号，导致假阳性结果会产生测试信号，导致假阳性结果微纤维微纤维-干扰干扰当血液凝集不充分时产生不成熟纤维即微当血液凝集不充分时产生不成熟纤维即微纤维纤维微纤维可与微粒和结合物连接，引起非特微纤维可与微粒和结合物连接，引起非特异性反应，导致假阳性结果异性反应，导致假阳性结果纤维凝块或微纤维干扰纤维凝块或微纤维干扰-对策对策采血采血后，正确的混匀，充分的凝集时间和离心后，正确的混匀，充分的凝集时间和离心离心前，血液凝集

11、完全十分重要离心前，血液凝集完全十分重要采血采血 颠倒混匀颠倒混匀 静置静置 离心离心 血清或血浆获取血清或血浆获取纤维凝块或纤维干扰（纤维凝块或纤维干扰（HBsAg)没有颠倒混匀，颠倒混匀不彻底影响很大离心时间影响也很大，应3000rpm离心15min分析中的质量控制分析中的质量控制 校准：何时做？如何判断？校准失败如何处理？ 首先进行外部质控品的检测，在控后，在进行患者标本检测 记录失控数据，按照质控规则判断结果是否在控 失控：查找原因，重新检查质控 在控：逐一审核报告试剂质量影响与对策试剂质量影响与对策 试剂盒原材料的纯度、组合、来源等也会造成结果的假阳性或假阴性 试剂灵敏度与特异性也存

12、在一定的差异 试剂应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便、快速的优良检查试剂 国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果 ，可作为选择试剂的主要依据 对策：选择高质量的试剂是关键分析后的质量控制分析后的质量控制结果审核程序 阳性复检（HIV、HCV和TP）肝炎标志物结果分析及报告程序HIV1/2抗体初筛实验结果报告程序与临床的联系和沟通室间室间质量评价质量评价EQA（1）参与室间质控网：根据实验室的具体情况而定 国际质控网 国家质控网 省级质控网 市级质控网 室间质量评价室间质量评价EQA（2）回报分析不合格PT结果 的调查张贴结果年度回顾分析常见影响因素和

13、常见影响因素和分析分析内源性干扰 外源性干扰 其他因素内源性干扰内源性干扰 类风湿因子（RF） 自身抗体 补体 嗜异性抗体（如医源性诱导的抗鼠Ig(S）抗体） 交叉反应物质 其他物质内源性干扰内源性干扰-RF IgG Fc段上抗原表位的一类自身抗体 患者体内的RF能干扰许多免疫学检测方法，IgG、IgM型RF可以与免疫检测系统中的捕获抗体及标记二抗的Fc段直接结合，从而导致检测结果假阳性或假性升高 RF对不同检测系统的干扰程度有所差异，影响程度并不与RF的浓度呈正比 目前临床使用的免疫检测试剂盒大部分没有很好的防止RF干扰的措施，国外著名公司要好于国内公司内源性干扰内源性干扰自身抗体自身抗体

14、嗜靶抗原的自身抗体，如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等，能与靶抗原结合形成复合物，在免疫检测系统中均可对靶抗原的测定结果造成负性干扰 判断嗜靶抗原的自身抗体对检测的负干扰，因紧密结合患者的疾病诊断、病史、其他实验室的结果综合分析。如甲亢、甲低、1型糖尿病等内源性干扰内源性干扰自身抗体自身抗体自身免疫病，如SLE、SS等感染性疾病会产生自身抗体，如梅毒、HIV等自身抗体干扰对策测定前标本需用理化方法将免疫复合物解离后再测定 内源性干扰内源性干扰补体补体 免疫检测系统中捕获抗体在向固相包被和标记抗体的标记过程中，抗体分子发生变构，其Fc段补体C1q分子结合位点暴露出来，使C1q可以将二者连接起来，从而造

15、成假阳性 一些公为了增加检测的敏感性，使用链霉亲和素包被固相，将捕获抗体用亲和素标记，此过程中也可引起捕获抗体的构象发生改变，造成假阳性或假性升高其他物质其他物质-干扰与对干扰与对策策血脂质过高和血粘度过大等，均对测定结果有干扰对策： 1、血脂层可用吸管吸取血脂层下血浆 2、血粘度过大导致仪器不测定，可采用手工法进行 3、采用另一种试剂测定内源性干扰内源性干扰 标本溶血 标本受细菌污染 标本储存时间过长溶血溶血干扰干扰 溶血的原因很多，只要有体外溶血和体内溶血两种 体外溶血可由物理因素（如机械性破坏、冰冻）、化学因素（如血样接触表面活性剂）和代谢因素（如遗传病引起的血细胞脆性增加）引起 体外溶血可由物理因素（人工心脏瓣膜或大血管手术后）、生物因素（如恶性疟疾）、毒素（如蜂毒素）和药物毒性反应等因素引起溶血溶血-干扰干扰标本溶血可导致红细胞的破坏、血红蛋白、白细胞碎片和蛋白等释放出来溶血对免疫检测的作用不仅是游离血红蛋白的影响，更多的是细胞碎片和蛋白质等其溶血产物；血红蛋白具有过氧化物酶活性，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，溶血因测定方法的不同可导致对免疫学检测的正向或负向干扰，而影响大小也有所差异标本受细菌污染标本受细菌污染-干扰和对策干扰和对策 因菌体中可能含有内源性过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，也可产生非特异性显