核酸分子杂交及芯片技术

1、核酸分子杂交及芯片技术核酸分子杂交及芯片技术Nucleic Acid Hybridization and DNA Chip Technologyu 核酸分子杂交的基本原理u 核酸探针u 核酸分子杂交技术方法u DNA芯片技术通过随机碰撞配对通过随机碰撞配对 缓慢缓慢“拉锁链拉锁链” 快快 可逆性(非共价结合)序列特异性(碱基互补配对)紫外吸收黏度沉降系数比旋度生物活性淬火退火核酸的变性与复性特点l u 核酸分子杂交的基本原理u 核酸探针核酸探针u 核酸分子杂交技术方法u DNA芯片技术靶分子：核酸（DNA or RNA）核酸探针: 1. 与靶核酸分子特异互补的核苷酸链。 2. 被标记，能被特殊

2、方法检测。实质：通过检测探针上的标志物来反应靶分子的 存在与否以及量的多少。随机引物（随机引物（6-8nt）：含：含有各种可能排列顺序的寡有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。核苷酸片段的混合物。46=4096 48=65536DNA聚合酶聚合酶Klenow片段：片段： 53DNA聚合酶活性聚合酶活性 弱弱35外切核酸酶活性外切核酸酶活性随机引物法（随机引物法（random priming）5-3外切酶活性使缺口平移5-3聚合酶活性上游链延伸而被标记u 核酸分子杂交的基本原理u 核酸探针核酸探针u 核酸分子杂交技术方法核酸分子杂交技术方法u DNA芯片技术 核酸分子杂交 固相杂交 液相杂交

3、膜上印迹杂交 核酸原位杂交核酸分子杂交的分类核酸分子杂交的分类 印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的固相支持物上的方法。指将待测核酸序列结合到一定的指将待测核酸序列结合到一定的支持物支持物上，上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。的过程。常用的固相支持物：常用的固相支持物： 硝酸纤维膜（硝酸纤维膜（NC） 尼龙膜尼龙膜 PVDF膜（聚二氟乙烯膜）膜（聚二氟乙烯膜）2印迹方法印迹方法 Methods of transfer虹吸印迹法（虹吸印迹法（Capillary）真空转移法（真空转移法（Vacuum）电转移法（电转移法（Electropho

4、retic）Blot DNA to membrane 1975年年 E. Southern Southern DNA 印迹转移技术印迹转移技术DNA片段片段15kb，18小时小时Electrophoretic blotting不宜用硝酸纤维素膜不宜用硝酸纤维素膜一般一般23小时，小时，最多最多6 8小时小时especially good for small fragments resolved by PAGE3060分钟分钟more efficient and quantitative than capillarymust apply vacuum evenly and not too str

5、ongly3印迹类型印迹类型 Southern印迹杂交印迹杂交 Northern印迹杂交印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交 菌落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交 原位杂交原位杂交提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性转移到转移到NC膜，高温烘烤膜，高温烘烤与与DNA或或RNA探针探针杂交杂交放射自显影放射自显影Southern blotting hybridization预杂交预杂交Southern印迹杂交的应用：印迹杂交的应用： 检测靶分子为检测靶分子为DNA, 检测靶分子是否检测靶分子是否含有目的基因。含有目的基因。 可用于可用于基因

6、组基因的定性及定量分析、克基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析、分析、DNA指纹图谱指纹图谱等。等。RNA极易被极易被RNase 降解降解RNA酶抑制剂酶抑制剂0.1%DEPC处理水处理水(焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯)Northern blotting hybridization检测靶分子为检测靶分子为RNA，单链，探针制备时需注意是否与靶分子配，单链，探针制备时需注意是否与靶分子配对。对。 pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heartmuscleGEF mRNANout

7、hern blotting hybridization优点：简单、迅速（直接点样）；优点：简单、迅速（直接点样）； 可在同一张膜上进行多个样品的检测；可在同一张膜上进行多个样品的检测；应用：同一种样品经不同倍数的稀释应用：同一种样品经不同倍数的稀释, 可以得到半定量的结果；可以得到半定量的结果； 核酸粗提样品的检测效果也较好。核酸粗提样品的检测效果也较好。Dot and slot blotting hybridization将变性后的将变性后的DNA或或RNA直接点样于膜上直接点样于膜上检测的是基因组DNA还是mRNA?用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片中核酸进行杂交检测的方法。

8、每张标本所用杂交液较少，20100l，为了避免杂交液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒。在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。1.细胞或组织的固定：载玻片2.组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质3.探针的选择和标记4.杂交5.杂交结果检测 探针与分裂中期染色体探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列杂交，研究特定核酸序列 在染色体中的精确定位；在染色体中的精确定位； 探针与细胞内探针与细胞内RNA进行杂交，观察该组织细胞中特定进行杂交，观察该组织细胞中特定 基因的表达水平；基因的表达水平； 用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进用特异性的细菌、

9、病毒的核酸作为探针对组织细胞进 行杂交，确定有无该行杂交，确定有无该病原体的感染病原体的感染。 应用：应用：FISH(荧光原位杂交荧光原位杂交)结果结果地高辛标记地高辛标记的探针用的探针用抗地高辛抗地高辛-罗丹明罗丹明显示显示(红色红色)生物素标记生物素标记的探针，用的探针，用抗生物素蛋白抗生物素蛋白-FITC显示显示(绿色绿色)1.荧光染色体原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization；FISH) 基本原理是将DNA探针用荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，来检测DNA序列在染色体上的定位。 2.比较基因组原位杂交(Comparative

10、Genomic Hybridization；CGH )由原位杂交发展起的一些新技术由原位杂交发展起的一些新技术 （一）核酸分子与固相介质的结合 1.噬菌体/克隆的转移 2.从凝胶上转移DNA:毛细转移、真空转移、电转移（二）核酸的固定：烘烤（80，2h）、紫外、碱（三）杂交：预杂交、杂交、洗脱（四）杂交信号的检测： 核酸分子的浓度和长度核酸分子的浓度和长度： 50300 bp, 0.10.5 g 2. 温度温度: Tm-253. 离子强度离子强度: Na+浓度约为浓度约为1 mol/L4. 杂交液中的甲酰胺杂交液中的甲酰胺: 50%甲酰胺甲酰胺,降低降低Tm5. 核酸分子的复杂性核酸分子的复杂

11、性6. 非特异性杂交反应非特异性杂交反应: 封闭封闭常用封闭物常用封闭物： 变性非特异变性非特异DNA：鲑鱼精子：鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺小牛胸腺DNA 高分子化合物：高分子化合物：Denhardt溶液溶液 脱脂奶粉脱脂奶粉 杂交方法杂交方法适适 用用 范范 围围Southern 印迹印迹检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的DNA分子，需转印到膜上分子，需转印到膜上Northern 印迹印迹检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上分子，需转印到膜上斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交检测未经分离的、固定在膜上的检测未经分离的、固定在膜上的DNA或或RNA分子分子菌

12、落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交检测固定在膜上的、经裂解后从细菌或噬菌体中释检测固定在膜上的、经裂解后从细菌或噬菌体中释放出的放出的DNA分子分子原位杂交原位杂交检测细胞或组织中的检测细胞或组织中的DNA或或RNA分子分子u 核酸分子杂交的基本原理u 核酸探针核酸探针u 核酸分子杂交技术方法核酸分子杂交技术方法u DNA芯片技术芯片技术生物芯片技术采用类似集成电路制作中的微加工技术，将生命科学研究中的若干不连续过程（如样品制备、生化反应、检测和分析步骤）集成到一块几平方厘米的芯片上，使这些分散的过程连续化与微型化，实现对大量生物样品中的各种数据的快速、自动和并行处理和分析。基因芯片技术是建立在上

13、的一种高效、快速的核酸序列分析手段。其是首先将大量探针分子固定于支持无上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行基因的分析。u芯片制备u样品制备u杂交反应u信号检测u结果分析 基本原理基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的待检测的DNA分子与芯分子与芯片温浴片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全拼接成完全的的DNA顺序。顺序。1 ATACGTTA2 GTTAGATC3 ACGTTAGA4 CGTTAGA